Biochemia Medica, Vol. 18 No. 1, 2008.
Stručni rad
Kvantitativna in situ hibridizacija povećane osjetljivosti u mekom, koštanom i zubnom tkivu pomoću RNA probi označenih digoksigeninom
Jelica Gluhak-Heinrich
Wuchen Yang
Marie A. Harris
Stephen E. Harris
Sažetak
Uvod: Kvantitativna neradioaktivna in situ hibridizacija je moćna tehnika za lokalizaciju ekspresije transkripata mRNA. Ove metode omogućavaju otkrivanje mRNA uz visoku rezoluciju na razini jedne jedine stanice. Dosad najšire opisani neradioaktivni protokoli rabili su deblje kriostatske rezove mekog tkiva i lokalizirali visoko zastupljene gene bez kvantificiranja.
Materijali i metode: Mi smo razvili metodu neradioaktivne in situ hibridi-zacije pomoću tankih rezova demineraliziranog koštanog tkiva uklopljenog u parafin, uz otkrivanje nisko zastupljenih gena i kvantifikaciju in situ signala. Naš protokol zasniva se na optimalnoj sintezi digoksigeninom obilježenih DNA probi za vizualiziranje vrlo nisko zastupljenih gena u mekom, koštanom i zubnom tkivu uklopljenom u parafin. Naša nova tehnika prikazuje in situ signal uz umnožavanje i pojačanje boje kroz reakciju alkalnefosfataze.
Rezultati: Osjetljivost je na razini radioaktivnih protokola, a rezolucija je na razini pojedine stanice, štoje bolje nego kod radioaktivnih protokola. Kvantificiranje in situ hibridizacijskog signala, što se ranije radilo pomoću radioaktivnog ili fluorescentnog obilježavanja, sad je moguće s alkalnom fosfatazom pomoću naše tehnike i programa ImageJ.
Zaključak: Prikazani primjeri pokazuju kako slijedeća metoda ima bolju dokazanu rezoluciju i jednaku osjetljivost kao radioaktivno obilježene metode u različitim tkivima s mogućom kvantifikacijom;to pak pokazuje da se ova metoda općenito može rabiti u istraživačkim kao i u kliničkim laboratorijima.
Ključne riječi
kvantitativna insitu hibridizacija; digoksigeninske probe; koštano tkivo uklopljeno u parafin
Hrčak ID:
20208
URI
Datum izdavanja:
18.2.2008.
Posjeta: 3.083 *