Varijacije u sadržaju fenola i antioksidacijske aktivnosti svježih i osušenih listova ružmarina (Rosmarinus officinalis L.) s obzirom na provenijenciju – područje Mostara, Bosna i Hercegovina

UVOD

INTRODUCTION

Ljekovite biljke čine posebnu skupinu biljaka koje sadrže različite biološki aktivne spojeve kao što su eterična ulja, alkaloidi, flavonoidi, saponini, tanini, vitamini, polisaharidi, organske kiseline, smole i druge tvari. Ove tvari imaju značajan utjecaj na ljudski organizam te se mnoge biljne vrste zbog svojih svojstava koriste u medicini, farmaceutskoj industriji (uključujući galenske laboratorije) (González-Minero i sur., 2020), kao i u prehrambenoj industriji za proizvodnju čajeva i začina (Ivanišová i sur., 2021) te u drugim prerađivačkim sektorima. Kada je u pitanju uzgoj i samonikli rast aromatičnog i ljekovitog bilja, neizostavno je spomenuti utjecaj geografskih, pedoloških i prirodnih uvjeta. Raznolikost reljefnih i klimatskih obilježja doprinijeli su prisutnosti velikog broja aromatičnih i ljekovitih biljnih vrsta na prostoru Mediterana, među kojima važno mjesto zauzima i ružmarin (Roša, 2010). Ružmarin (Rosmarinus officinalis L.) je biljna vrsta iz porodice Lamiaceae (Carrubba i sur., 2020). Spontano raste na planinama, liticama i kamenitim mjestima, u blizini mora, posebice u mediteranskom području, a rasprostranjena je u Africi, Europi i Aziji (Kompelly i sur., 2019). Danas je raširen u mnogim vegetacijskim zajednicama duž područja eumediteranske, a posebno stenomediteranske vegetacijske zone.

Na našim prostorima zajednice ružmarina su sasvim udomaćene i pripadaju bušicima zapadnomediteranskih zajednica ružmarina (red. Rosmarinetalia) (Kovačić i sur., 2008).

Bušici

Razred: Erico-Cistetea Trinajstić (1978) 1985.

Sredozemni bušici na bazičnoj podlozi

Red: Rosmarinetalia Br.-Bl. 1931 em. 1951

Zapadnomediteranski bušici ružmarina

Sveza: Rosmarino-Ericion manipuliflorae Br.-Bl. 1931 (Trinajstić, 1990) Erico manipuliflorae-Rosmarinetum H-ić 1958 Bušik ružmarina s mnogocvjetnom resikom).

Bušik ružmarina rasprostranjen je u svom tipičnom obliku u sastavu stenomediteranske vegetacijske zone mediteransko-litoralnog vegetacijskog pojasa na otocima Hvaru, Visu, Biševu i Svecu. U oskudnijoj formi javlja se i na otocima Braču i Lastovu. U florističkom sastavu bušika javljaju se sljedeće vrste: Rosmarinus officinalis, Erica multiflora, Cistus monpeliensis, Cistus incanus, Cistus salvifolius, Fumana laevipes, Fumana arabica, Ononis minutissima i druge (Trinajstić, 1998, 2008; Vukelić, 2012).

Ljekoviti dijelovi ružmarina su: cvijet (Rosmarini flos), izdanci u cvatu (Rosmarini herba), list (Rosmarini folium) i eterično ulje (Rosmarini aetheroleum). Najčešće se koriste njegovi listovi. Ružmarin može doseći visinu od približno 1 m do 2.5 m. Stabljike su četverokutne uspravne i imaju tendenciju lignificiranja u drugoj godini. Gusto su prekrivene sitnim, igličastim listovima bez peteljki. Listovi su linearni, s cijelim, blago zaokrenutim rubovima koji su odozgo tamnozeleni, a odozdo svjetliji. Ružmarin cvjeta od početka lipnja do kolovoza. Cvjetovi su vrlo mali, bijeli ili ljubičastoplavi, skupljeni u terminalne grozdaste cvatove (Pawłowska i sur., 2020). Ružmarin je aromatična biljna vrsta izražene antioksidacijske aktivnosti zahvaljujući relativno visokom sadržaju fenolnih spojeva (Ou i sur., 2018). Ružmarin se može koristiti u svježem stanju, osušen u obliku eteričnog ulja ili ekstrakta. Kao ukrasna biljna vrsta često se koristi u hortikulturi prilikom uređenja zelenih površina i park šuma na Mediteranu (Dorbić i Temim, 2018; Gašparović i sur., 2022). Ružmarin može inducirati različite farmakološke učinke zbog interakcije između njegovih molekula i organskih sustava. Učinci koje pokazuje ova biljka uključuju sposobnost ublažavanja: astme, ateroskleroze, antioksidacijsko i protuupalno djelovanje ružmarinske kiseline, kontrola hiperkolesterolemije i oksidativnog stresa te ublažavanje fizičkog i mentalnog umora, antiulkusno djelovanje. Ružmarin je poznat po svom antivirusnom i antimikrobnom djelovanju, kao i po svojoj sposobnosti da ublaži depresivno ponašanje. (Oliveira i sur., 2019). Njegove aktivne tvari kao na primjer carnosol koji je fenolni diterpenoid koji ima protuupalno, antitumorsko i antioksidacijsko djelovanje (Lee i Im, 2021). Ružmarinska kiselina ima širok spektar farmakoloških učinaka: antioksidacijsko, anti-apoptotičko, antitumorsko i antiinflamatorno djelovanje (Luo i sur., 2020). Spojevi koji imaju antioksidacijsko djelovanje iz ekstrakta ružmarina i eteričnog ulja ružmarina mogu usporiti oksidaciju lipida u biološkim sustavima, kao i u prehrambenim proizvodima. Prema istraživanju Nieto i sur. (2018) antioksidacijsko i antimikrobno djelovanje ružmarina uveliko ovisi o fazi plodonošenja, prirodi ekstrakata, kao i načinu ekstrakcije, prisutnosti inhibitora te sinergističkom učinku s drugim komponentama, kao i koncentraciji aktivnog ekstrakta. Ružmarin i njegovi proizvodi nalaze široku primjenu u prehrambenoj, farmaceutskoj te kozmetičkoj industriji. Ružmarin se ponajprije koristi zbog svog eteričnog ulja i visokog udjela fenolnih spojeva koji pokazuju bioaktivna svojstva poput antioksidativnog, antifungalnog, antibakterijskog i protuupalnog djelovanja, a sve to pozitivno utječe na ljudsko zdravlje. Prema Irakli i sur. (2023) antioksidacijski i fenolni spojevi iz ružmarina poboljšavaju obranu organizma i ublažavaju oksidativni stres. Ružmarinov čajni oparak povoljno djeluje na detoksikaciju organizma (Dorbić i sur., 2022). Osim blagotvornog učinka na zdravlje ljudi, potražnja prehrambene industrije za prirodnim antioksidansima i konzervansima čini fenolne ekstrakte ružmarina atraktivnim i funkcionalnim sastojkom prilikom formulacije prehrambenih proizvoda (Irakli i sur., 2023). Procjena antioksidacijskog potencijala ekstrakata ružmarina je bitna zbog varijacija u antioksidacijskim komponentama koje se mogu dobiti ovisno o korištenom otapalu. Prema Al Jaafreh (2024) primjenom različitih otapala moguće je ekstrahirati komponente ružmarina koje mogu imati različite učinke na antioksidacijsko djelovanje. Kod biljaka postoji višerazinska i složena mreža antioksidacijskog sustava koja djeluje suprotstavljajuće prema štetnim reaktivnim vrstama, među kojima se najviše ističu reaktivne kisikove vrste, a sve s ciljem održavanja homeostaze unutar stanice (Dumanović i sur., 2021). Antioksidacijska aktivnost odnosi se na uklanjanje reaktivnih vrsta kisika (ROS) odnosno štetnih reaktivnih kisikovih molekula koje nastaju prirodnim fiziološkim djelovanjem, na primjer starenjem, infekcijom, toksinima ili pretjeranom tjelovježbom (Wang i sur., 2022; Nunes-Silva i Freitas-Lima, 2015; Marschall i Tudzynski, 2016). Predstavljaju skupine slobodnih radikala, reaktivnih molekula i iona izvedenih iz O₂. Reaktivne kisikove vrste nastaju kao normalni produkt staničnog metabolizma kod biljaka, a različiti okolišni stresovi mogu dovesti do prekomjerne proizvodnje istih, uzrokujući progresivno oksidativno oštećenje te na kraju smrt stanice (Sharma i sur., 2012). Antioksidacijska svojstva fenola mogu se predstaviti i kroz mehanizam, odnosno sposobnost modifikacije kinetike peroksidacije mijenjanjem “paketa” lipida i smanjenjem fluidnosti membrane. Navedene promjene mogu dovesti do ograničavanja difuzije slobodnih radikala i smanjenja reakcije peroksidacije (Takahama i Oniki, 1992; prema Dumanović i sur., 2021). Bioaktivna svojstva ružmarina ponajprije se pripisuju fenolnim spojevima. Biljke proizvode fenolne spojeve uglavnom za njihov rast, razvoj i zaštitu. Navedeni spojevi aromatičnog benzenskog prstena su itekako bitni tijekom interakcija biotičkog i abiotičkog stresa u biljci. Oni čine bitan dio sekundarnih metabolita biljaka i igraju vitalnu ulogu u različitim fiziološkim i mehaničkim aktivnostima. Međutim, važno je uzeti u obzir da ova biološka svojstva ovise o različitim faktorima. Cilj ovoga rada je utvrditi varijacije u sadržaju ukupnih fenola i antioksidacijske aktivnosti svježeg i osušenog lista ružmarina u ovisnosti od njegovog porijekla iz urbane i ruralne sredine, te rezultate usporediti s komercijalnim uzorkom. Također, istraživanja Chrysargyris i sur. (2020) pokazuju da lokalitet i nadmorska visina utječu na razinu polifenola u ljekovitom bilju,a analiza istog je jedan od ciljeva ovoga rada.

MATERIJALI I METODE

MATERIALS AND METHODS

Biljni materijal - Plant material

Biljni materijal R. officinalis prikupljen je u svibnju 2024. godine iz urbane sredine (Lokacija: Latitude: 43°21'34"N; Longitude 17°48'54"E; Zalik, grad Mostar, BiH; nadmorska visina: 67 m) i ruralne sredine (Lokacija: Latitude: 43.1836124; Longitude 17.7909700; selo Pijesci, Općina Mostar, BiH; nadmorska visina: 250 m). Svježi uzorci biljnog materijala R. officinalis prikupljeni su u lipnju 2024. godine na opisanim lokacijama iz urbane i ruralne sredine. Berba lišća obavljena je u jutarnjim satima, između 9 i 10 h ujutro. Za potrebe ovoga istraživanja koristili su se listovi ružmarina. Botaničku pripadnost prikupljenog biljnog materijala Rosmarinus officinalis potvrdio je izv. prof. dr. sc. Boris Dorbić; prof. struč. stud. korištenjem relevantne florističke literature (Kovačić i sur., 2008; Nikolić i sur., 2020). Biljni materijal stavljen je na sušenje u prozračne drvene kutije u tankom sloju, na otvorenom prozračnom mjestu (pod strehom u hladu) do provedbe analiza.

Kemikalije - Chemicals

Folin-Ciocalteu reagens – Kemika Zagreb (Hrvatska), Natrij karbonat (Na₂CO₃) – Centrohem (Srbija), Galna kiselina (C₇H₆O₅H₂O) –Fluka Chemica (Švicarska), destilirana voda, etanol (C₂H₆O) – Gram –Mol (Hrvatska), TROLOX -6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina - (C₁₄H ₁₈O₄) - Tokyo Chemical Industry (Japan), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil - (C₁₈ H₁₂N₅O₆) – Sigma – Aldrich - (USA).

Aparatura - Apparatus

Evolution 60s UV-Visible Spectrophotometer, MEMMERT vodena kupelj, IKA Lab Dancer Vortex, Mettler Toledo analitička vaga.

Procedura za ekstrakciju uzoraka listova biljnog materijala Rosmarinus officinalis - Procedure for the extraction of leaf samples of Rosmarinus officinalis plant material

Osušeni i usitnjeni listovi biljnog materijala podvrgnuti su maceraciji u destiliranoj vodi i 70 %-tnoj vodenoj otopini etanola pri sobnoj temperaturi u svrhu ekstrakcije. U Erlenmayerovu tikvicu od 100 mL izvagano je 1 g usitnjenog biljnog materijala, potom dodano 25 mL otapala (destilirana voda i vodena otopina etanola) te ostavljeno na maceraciji u vremenu od 72 sata. Po završetku maceracije sadržaj tikvice je filtriran kroz lijevak s filter papirom u odmjernu tikvicu od 25 mL, te nadopunjen do oznake korištenim otapalom. Na isti način provedena je maceracija i svježeg biljnog materijala.

Folin-Ciocalteu metoda za određivanje ukupnih fenola

Folin-Ciocalteu method for the determination of total phenols

Za određivanje sadržaja ukupnih fenola korištena je metoda prema Folin-Ciocalteu (Singelton i Rosi, 1965), a analiza je provedena sredinom lipnja 2024. godine u laboratoriju katedre za farmakognoziju na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Sarajevu. Metoda se temelji na spektrofotometrijskom mjerenju sadržaja ukupnih fenola u reakcijskoj smjesi ispitivanog ekstrakta, destilirane vode, Folin-Ciocalteu reagensa (smjesa fosfomolibdatne i fosforvolframatne kiseline) i 20 % otopine natrij-karbonata. Reakcijska otopina poprima intenzivno plavu boju, a intenzitet boje je proporcionalan koncentraciji fenolnih spojeva. Koncentracija ukupnih fenola, koristeći galnu kiselinu kao standard, izračunata je prema jednadžbi smjera dobivenoj u softverskom programu Excel 2010. Na apscisu su nanesene koncentracije galne kiseline (mg/L), dok su vrijednosti apsorbancije, izmjerene na 765 nm pomoću Evolution 60s UV-Visible spektrofotometra, nanesene na ordinatu.

Postupak određivanja ukupnih fenola - Procedure for the determination of total phenols

Prethodno razrijeđeni alikvot volumena 125 μL ekstrakta ružmarina otpipetiran je u staklenu epruvetu, nakon čega je dodano 625 μL Folin-Cioalteu reagensa te 10 mL destilirane vode. Nakon 3 minute dodano je 1,9 mL zasićene otopine natrij karbonata. Dobivena smjesa je potom izmiješana korištenjem Vorteks mješalice, nakon čega su uzorci postavljeni na termostatiranje u vodenu kupelj pri temperaturi od 50 °C u vremenu od 25 minuta. Po završetku provedeno je spektrofotometrijsko mjerenje apsorbancije pri valnoj duljini od 765 nm korištenjem UV-Vis spektrofotometra (Evolution 60s UV-Visible Spektrofotometar).

DPPH metoda za određivanje antioksidacijske aktivnosti

Determination of antioxidant activity by DPPH method

Goldschmidt i Renn su 1922. godine otkrili DPPH radikal (Goldschmidt i Renn, 1922; prema Gulcin i Alwasel, 2023). Blois je 1958. godine razvio metodu za određivanje antioksidacijske aktivnosti koristeći stabilni slobodni DPPH radikal (Blois, 1958; prema Gulcin i Alwasel, 2023). DPPH metoda je i danas jedna od najčešće korištenih metoda za određivanje antioksidacijske aktivnosti. Postupak se temelji na miješanju biljnih ekstrakata s DPPH otopinom, te se nakon određenog vremena mjeri njihova apsorbancija (Gulcin, 2023). DPPH, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil predstavlja široko korišteni stabilni organski dušikov radikal specifične tamnoljubičaste boje, s jakom apsorpcijom na 517 nm koja se objašnjava elektronom DPPH•. Molekule antioksidanasa reduciraju radikal pri čemu dolazi do transformacije u 2,2-difenil-1-pikrilhidrazin blijedožuti stabilan spoj, a zbog sparivanja elektrona smanjuje se i apsorpcija (Bora, 2023). U ovoj reakciji dolazi do smanjenja stabilnog slobodnog DPPH radikala. Slobodni DPPH radikal dolazi u interakciju s neparnim elektronom i stvara maksimalnu apsorpcijsku valnu duljinu od 517 nm (ljubičasto obojenje). Antioksidansi reagiraju s DPPH i stvaraju izvod vodika (naprimjer antioksidans “hvata” slobodne radikale), a to rezultira redukcijom DPPH do DPPH-H, te smanjenjem apsorpcije DPPH, (Baliyan i sur., 2022). Kao slijepa proba koristi se otopina pripravljena miješanjem 5 mL 25 mM DPPH otopine s 5 mL metanola. Referentna otopina koristi se kao baza pri usporedbi s uzorcima, a čija se apsorbancija mjeri na 517 nm pomoću spektrofotometra. Apsorbancija uzorka i slijepe probe se mjeri nakon perioda inkubacije od 30 minuta, a potom se izračunava postotak (I %) inhibicije slobodnog DPPH radikala. Izračunavanje postotka inhibicije s pomoću jednadžbe:

Pri čemu je:

Aktivnost hvatanja radikala ili RSA [%] izračunava se uporabom formule:

Pri čemu je:

Iscrtavanjem Trolox kalibracijske krivulje, izračunava se koncentracija Trolox ekvivalenta (TE), odnosno cTE sljedećom formulom:

pri čemu je:

U sljedećem koraku, vrijednost TEAC određuje se s pomoću molarne mase Trolox koja iznosi 250,3 ^g/_mol i koncentracije otopine uzorka c_sample:

[TeX:] \text{TEAC\ }\left\lbrack \frac{\text{μmol}}{g} \right\rbrack = \ \frac{c_{\text{TE}}*\ \frac{1}{M_{\text{TROLOX}}}}{c_{\text{sample}}}$\mathrm{\text{TEAC}}\left[\frac{\mathrm{\text{μmol}}}{g}\right]=\frac{c_{\mathrm{\text{TE}}}*\frac{1}{M_{\mathrm{\text{TROLOX}}}}}{c_{\mathrm{\text{sample}}}}$ (Rumpf i sur., 2023).

Postupak određivanja antioksidacijske aktivnosti pomoću DPPH metode - Procedure for the determination of antioxidant activity by DPPH method

Antioksidacijska aktivnost uzoraka određivana je prema metodi Aoshima i sur. (2004). U 100 µL ekstrakta uzorka dodano je 2,9 mL prethodno pripremljenog DPPH reagensa i promiješano. Reakcijska smjesa je ostavljena na sobnoj temperaturi 30 minuta, nakon čega je mjereno DPPH obezbojenje u odnosu na slijepu probu na 517 nm uporabom UV-Vis spektrofotometra (Evolution 60s UV-Visible Spektrofotometar).

Statistička analiza - Statistical analysis

Svi uzorci su analizirani u triplikatima, a rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± ST DEV. Dobiveni rezultati su izračunati uporabom Excel 2010. softverskog programa. Uz softverski program Excel 2010., korišten je i IBM SPSS softver verzija 27. za provjeru statističkih razlika u odnosu na provenijenciju iz urbane i ruralne sredine te komercijalni uzorak, kao i provjeru statističkih razlika u odnosu na uporabu različitih otapala: etanol 70 % i destilirana voda. U ovoj analizi korišteni su parametrijski testovi: One-Way ANOVA i t-test.

REZULTATI I DISKUSIJA

RESULTS AND DISCUSSION

Određivanje sadržaja ukupnih fenola - Determination of the total phenolic content

Fenolne molekule su najvažnije klase prirodnih antioksidansa i u velikoj su korelaciji s antioksidacijskim djelovanjem u biljnim tkivima. Svrha istraživanja bila je usporediti polifenolni profil ekstrakata ružmarina dobivenih iz suhog i svježeg lista biljnog materijala prikupljenog s različitih nadmorskih visina, te procijeniti njihovo antioksidacijsko djelovanje.

Srednje vrijednosti ukupnih fenola u ovisnosti od primijenjenog otapala, nadmorske visine te stanja biljnog materijala (suhi ili svježi) prikazane su na grafikonu 1.

*Svi uzorci su analizirani u triplikatima.

*All samples were analyzed in triplicate.

Grafikon 1. Srednje vrijednosti sadržaja ukupnih fenola u ovisnosti od primijenjenog otapala, nadmorske visine te stanja biljnog materijala (suhi ili svježi).

Graph 1. Mean values of total phenolic content depending on the applied solvent, altitude, and state of the plant material (dry or fresh).

Iz grafikona 1. može se uočiti da udio ukupnih fenola varira u rasponu od 36,11 ± 0,96 do 233,07 ± 1,66 mg GAE/g, ovisno o vrsti korištenog otapala i stanja biljnog materijala. Uporabom vodene otopine etanola 70 % postiže se veći ekstrakcijski prinos u svim uzorcima ružmarina u odnosu na uzorke koji su ekstrahirani s vodom. Najveći udio fenola pokazuje suhi komercijalni uzorak, čija vrijednost iznosi 233,07 ± 1,66 mg GAE/g koji je ekstrahiran u etanolu, dok najmanji udio fenola pokazuje suhi uzorak ružmarina sakupljen u urbanoj sredini, a čija vrijednost iznosi 36,11 ± 0,96 mg GAE/g, a koji je ekstrahiran u vodi. Prema istraživanju Hu i sur. (2016) pri koncentraciji etanola od oko 70 %, prisutnost vode u otapalu uzrokuje umjereno bubrenje materijala lista ružmarina, čime se olakšava prodiranje otapala u materijal. S druge strane velika količina vode u otapalu dovodi do prekomjernog bubrenja materijala i nepovoljnog polariteta otapala, što doprinosi smanjenom prinosu ekstrakcije. U istraživanju Minh-Tam i sur. (2021) utvrđena je značajna varijacija u sadržaju fenola ovisno o vrsti i koncentraciji korištenog otapala. Sadržaj fenola kretao se od 59 mg GAE/g kada je korišten 70 % etanol kao otapalo, do 37,5 mg GAE/g u uzorku koji je ekstrahiran s vodom. Istraživanje koje su proveli Dhouibii sur. (2023) pokazalo je da je najveća ukupna koncentracija fenola u ružmarinu zabilježena kada je etanol korišten kao otapalo (85 mg GAE/g). Ovi rezultati mogu se objasniti afinitetom polifenola, koji su polarni spojevi, prema polarnim otapalima kao što je etanol. Istraživanje Ahmeda i sur. (2022) ukazuje na veći sadržaj fenolnih spojeva korištenjem etanola u odnosu na druga otapala. U ovoj studiji sadržaj fenolnih spojeva u ružmarinu iznosio je 26,43 ± 1,55 mg GAE/g. U istraživanju Kheiria i sur. (2021) objavljeno je da se sadržaj fenola u ekstraktu ružmarina kretao od  85,8 do 137,3 mg GAE/g. Njihovi rezultati su relativno slični rezultatima ovoga istraživanja. Suprotno tomu, sadržaj ukupnih fenola u vodenim ekstraktima koje su istraživalii sur. (2013) iznosila je 16,67 ± 0,40 mg GAE/g, što predstavlja značajno niže vrijednosti u usporedbi s rezultatima dobivenim ovim istraživanjem. Na sadržaj fenola jasno utječu visinske varijacije, pri čemu su uzorci s veće nadmorske visine pokazali veći sadržaj fenola u usporedbi s uzorcima s niže nadmorske visine. Uzorci s viših nadmorskih visina pokazali su veći sadržaj fenola koji su varirali u rasponu od 71,52 ± 0,48 do 130,59 ± 0,83 mg GAE/g, dok su uzorci s niže nadmorske visine pokazali relativno manji sadržaj fenola koji su varirali u rasponu od 36,11 ± 0,96 do 102,14 ± 1,92 mg GAE/g. Studije koje su proveli Yeddes i sur. (2019) o učinku bioklimatskog područja na fenolne i antioksidacijske aktivnosti ružmarina pokazali su da postoji jaka korelacija između antioksidacijske aktivnosti i sadržaja fenola ovisno o bioklimatskom području. Sadržaj fenola kretao se od 39,15 mg GAE/g za područje s većom nadmorskom visinom do 26,66 mg GAE/g za područje s nižom nadmorskom visinom. Ovi rezultati korespondiraju s rezultatima ove studije koji ukazuju da uzorci s većih nadmorskih visina pokazuju veći sadržaj fenolnih spojeva.

Proces sušenja je ključni faktor koji omogućava očuvanje kvalitete ljekovitog bilja i njihovih bioaktivnih ekstrakata i spojeva. Za sušenje svježeg biljnog materijala koriste se različiti načini kao što su sušenje na zraku, sušenje u sušarama (Ahmed i sur., 2021). Svježe bilje iz porodice Lamiaceae obično sadrži 75 – 80 % vode, a udio vode mora se smanjiti na manje od 15 % radi njihovog očuvanja (Diaz-Maroto i sur., 2002). U ovom radu svježi biljni uzorci sušeni su na zraku kako bi se osiguralo očuvanje kvalitete ljekovitog bilja. Proces sušenja značajno je utjecao na ukupan sadržaj fenolnih spojeva. Rezultati istraživanja pokazuju da je ukupan sadržaj fenolnih spojeva znatno veći u osušenim listovima ružmarina u usporedbi sa svježim listovima. Sadržaj fenolnih spojeva varirao je od 55,69 ± 1,44 mg GAE/g za vodeni ekstrakt ružmarina s niže nadmorske visine koji je sušen na zraku do 233,07 mg GAE/g za komercijalni etanolni ekstrakt ružmarina. Studija provedena od Bieżanowska-Kopeć i Piątkowska (2022) pokazuje znatno veće vrijednosti sadržaja fenolnih spojeva kod komercijalnih uzoraka ružmarina u odnosu na svježu biljku. Vrijednosti komercijalnih uzoraka iznosile su 579,39 ± 152,41 mg GAE/g, dok su vrijednosti fenolnih spojeva svježe biljke ružmarina iznosile 423,31 ± 2,39 mg GAE/g. Navedeni rezultati su u skladu s rezultatima ovoga istraživanja, koji ukazuju da komercijalni uzorci pokazuju veći sadržaj fenolnih spojeva u odnosu na svježe uzorke. Većina studija ukazuje na promjene u boji i isparljivim spojevima aromatičnog bilja nakon sušenja (Di Cesare i sur., 2003; prema Diaz-Maroto i sur., 2002), što je slučaj i u ovome radu. Analizom dobivenih rezultata može se zaključiti da 70%-tni ekstrakti etanola doprinose značajnijem ekstrakcijskom kapacitetu za izolaciju ukupnih fenola iz ružmarina. Osim toga, veća nadmorska visina te uzorci koji su sušeni na zraku također pospješuju ekstrakcijski kapacitet za izolaciju fenolnih spojeva.

Tablica 1. One-Way ANOVA za provenijenciju iz urbane/ruralne sredine i t-test za primjenu različitih otapala: etanol 70 % i voda, za rezultate antioksidacijske aktivnosti.

Table 1. One-way ANOVA for provenance from the urban/rural environment and t-test for the application of different solvents: ethanol 70% and water, for the results of antioxidant activity.

Iz tablice 1. je vidljivo da primjenom One-Way ANOVA testa postoji razlika (0,015 < 0,05) u sadržaju ukupnih fenola analiziranih uzoraka u odnosu na provenijenciju iz urbane/ruralne sredine, a bitno je napomenuti isticanje vrijednosti uzoraka komercijalnog biljnog materijala (i vodenog i etanolnog). Ne postoji razlika u sadržaju ukupnih fenola analiziranih uzoraka s obzirom na uporabu različitog otapala u procesu ekstrakcije (0,137 > 0,05).

Određivanje antioksidacijske aktivnosti - Determination of antioxidant activity

Prilično je teška identifikacija svake pojedinačne komponente koja ima antioksidacijski učinak, te je za istu potrebno mnogo vremena i truda. Iz tog razloga, u praksi se primjenjuje nekoliko metoda za određivanje antioksidacijske aktivnosti cijeloga ekstrakta (Adris i sur., 2019). Antioksidacijska aktivnost iz listova biljnog materijala ružmarina određivana je uporabom DPPH metode. Prema istraživanju Yeddera i sur. (2019) visoka antiradikalna aktivnost lista biljnog materijala ružmarina u ljetnom periodu usko je povezana s visokim sadržajem ukupnih fenola, ukupnih flavonoida, kondenziranih tanina te karnozne kiseline.

Za određivanje antioksidacijske aktivnosti DPPH metodom korišteni su 70 %-tni etanol i voda kao otapala, odnosno etanolni i vodeni ekstrakti svježeg i osušenog biljnog materijala ružmarina iz urbane i ruralne sredine, kao i ekstrakti komercijalnog biljnog materijala. Određivanje antioksidacijske aktivnosti iz ekstrahiranih uzoraka ružmarina primjenom različitih otapala podrazumijeva ispitivanje učinkovitosti upotrijebljenih otapala u ekstrakciji. Najučinkovitije otapalo u ekstrakciji smatra se ono upotrijebljeno otapalo čiji ekstrakt rezultira s najvećom antioksidacijskom aktivnošću (Al-Jaafreh, 2024). Procjena DPPH rezultata, odnosno sposobnosti uklanjanja radikala izražena je primjenom standarda Trolox-a kao ekvivalenta (µmol TE/g), prikazano grafikonom 2. Rezultati DPPH metode za analizirane uzorke predstavljeni su preko linearne kalibracijske krivulje Trolox-a s koeficijentom regresije R² = 0,998. Analizirani ekstrakti podijeljeni su u tri grupe s obzirom na provenijenciju iz urbane i ruralne sredine te komercijalni biljni materijal. Najviše vrijednosti antioksidacijske aktivnosti imali su etanolni ekstrakti (od 712,70 ± 1,90 do 934,06 ± 0,77 µmol TE/g) bez obzira na provenijenciju biljnog materijala urbane/ruralne sredine i stanja uzorka (suhi/svježi). Prema istraživanju Bianchin i sur. (2020) etanolni ekstrakt ružmarina je imao sadržaj od 4745,72 ± 0,47 µmol TE/g, što ukazuje na izuzetno visoke antioksidacijske vrijednosti izražene kao Trolox (TE), a studija sugerira da bi se analizirani ekstrakti mogli koristiti kao prirodni antioksidansi u proizvodima od mesa. Prema istraživanju Al-Jaafreh (2024) pri usporedbi s Troloxom, ekstrakcija polarnim otapalima pokazivala je najjači antioksidacijski učinak, dok je ekstrakcija s nepolarnim otapalima imala najniži antioksidacijsku aktivnost.

*Svi uzorci su analizirani u triplikatima.

*All samples were analyzed in triplicate.

Grafikon 2. Rezultati DPPH metode za analizirane uzorke izraženi primjenom standarda Trolox-a kao ekvivalenta (µmol TE/g).

Graph 2. Results of the DPPH method for the analyzed samples expressed using Trolox standards as equivalents (µmol TE/g).

Razlike u antioksidacijskoj aktivnosti vidljive su kod vodenih ekstrakata, čije su vrijednosti od 164,13 ± 4,04 do 867,70 ± 1,98 µmol TE/g. Vodeni ekstrakti pokazuju niže vrijednosti antioksidacijske aktivnosti bez obzira na provenijenciju i stanje uzorka. Ističe se samo vodeni ekstrakt komercijalnog uzorka. Drugim riječima, etanolni ekstrakt komercijalnog uzorka s vrijednošću od 934,06 ± 0,77 µmol TE/g skoro je 5,69 puta veći od vodenog ekstrakta ruralnog područja, čija je vrijednost iznosila 164,13 ± 4,04 µmol TE/g. Razlike u vrijednostima antioksidacijske aktivnosti primjenom ORAC metode za etanolni i vodeni ekstrakt su vidljive i u istraživanju Kotenkova i Kupaeva (2021), pri čemu su rezultati za uzorak suhog ružmarina u etanolnom ekstraktu iznosili 728,25 ± 2,14 µmol-equiv. Trolox/g, a za vodeni ekstrakt 299,98 ± 16,74 µmol-equiv. Trolox/g. Odnosno, ukupni antioksidacijski kapacitet etanolnog ekstrakta ružmarina bio je 2,43 puta veći od vodenog ekstrakta (Kotenkova, Kupaeva, 2021).

Aktivnost hvatanja slobodnih radikala u metanolnom ekstraktu Rosmarinus officinalis, određivali su Adris i sur. (2019), pri čemu je vrijednost antioksidacijske aktivnosti prema DPPH metodi iznosila 259,67 ± 0,48 µmol TE/g suhe tvari. U istraživanju metabolomike i kemometrije,De Falco i sur. (2022) ispitivali su antioksidacijsku aktivnost ekstrakata lišća sedam biljnih vrsta, a među njima i ekstrakt ružmarina, koji je prema DPPH metodi izražen kao mM/TE g suhe tvari s vrijednošću 1,04 ± 0,01. Usporedbe radi, antioksidacijska aktivnost prema DPPH metodi ispitivanog uzorka esencijalnog ulja ružmarina koje su provodili Barakat i Ghazal (2016) iznosila je 234,7 ± 7,1 µmol TE/g.

Tablica 2. One-Way ANOVA za provenijenciju iz urbane/ruralne sredine i t-test za primjenu različitih otapala: 70%-tni etanol i voda, za rezultate antioksidacijske aktivnosti.

Table 2. One-way ANOVA for provenance from the urban/rural environment and t-test for the application of different solvents: ethanol 70% and water, for antioxidant activity results

Uvidom u rezultate prikazane u tablici 2.može se zaključiti da primjenom One-Way ANOVA testa nema razlike u antioksidacijskoj aktivnosti uzoraka u odnosu na provenijenciju iz urbane/ruralne sredine (0,317 > 0,05), s tim što je bitno napomenuti isticanje uzoraka komercijalnog biljnog materijala (i vodenog i etanolnog). Razlike se ogledaju u antioksidacijskoj aktivnosti analiziranih uzoraka s obzirom na uporabu različitog otapala u procesu ekstrakcije (0,013 < 0,05).

ZAKLJUČAK

CONCLUSION

Analiziranjem dobivenih rezultata nakon provedenog istraživanja može se zaključiti da ekstrakti lista biljke ružmarina (Rosmarinus officinalis L.) imaju visoku antioksidacijsku aktivnost i bogat su izvor fenolnih spojeva, što je potvrđeno DPPH metodom za određivanje vrijednosti antioksidacijske aktivnosti i udjelima ukupnih fenola određenih spektrofotometrijskim metodama. Visoka antiradikalna aktivnost lista biljnog materijala ružmarina usko je povezana s visokim sadržajem ukupnih fenola.

Rezultati dobiveni određivanjem ukupnih fenola kreću se od 36,11 ± 0,96 do 233,07 ± 1,66 mg GAE/g, ovisno o vrsti korištenog otapala i stanja biljnog materijala (suhi/svježi). Pregledom dobivenih rezultata zaključuje se da vodeni ekstrakti etanola 70 % značajno doprinose većem ekstrakcijskom kapacitetu za izolaciju ukupnih fenola iz ružmarina.

Najviše vrijednosti antioksidacijske aktivnosti imali su etanolni ekstrakti (712,70 ± 1,90 do 934,06 ± 0,77 µmol TE/g) bez obzira na provenijenciju biljnog materijala urbane/ruralne sredine i stanja uzorka (suhi/svježi). Vodeni ekstrakti pokazuju niže vrijednosti antioksidacijske aktivnosti bez obzira na provenijenciju i stanje uzorka. Primjenom One-Way ANOVA testa vidljivo je da postoji razlika (0,015 > 0,05) u sadržaju ukupnih fenola analiziranih uzoraka u odnosu na provenijenciju iz urbane/ruralne sredine, a bitno je napomenuti isticanje vrijednosti uzoraka komercijalnog biljnog materijala (vodenog i etanolnog), a ispitivanje postojanja razlike bio je jedan od ciljeva rada. U sadržaju ukupnih fenola analiziranih uzoraka ne postoji razlika s obzirom na uporabu različitog otapala u procesu ekstrakcije (0,137 > 0,05). Kada govorimo o antioksidacijskoj aktivnosti primjenom One-Way ANOVA testa može se zaključiti da nema razlike u antioksidacijskoj aktivnosti uzoraka u odnosu na provenijenciju iz urbane/ruralne sredine (0,317 > 0,05), s tim što je i u ovom slučaju bitno napomenuti isticanje uzoraka komercijalnog biljnog materijala (i vodenog i etanolnog). Razlike se ogledaju u antioksidacijskoj aktivnosti analiziranih uzoraka s obzirom na uporabu različitog otapala u procesu ekstrakcije (0,013 < 0,05).

Dobiveni rezultati ukazuju na značaj i potencijal ružmarina kao biljnog materijala ili mogućeg predmeta daljnjih istraživanja u kontekstu pregleda značajnih bioloških aktivnosti. Istraživanjem naglašavamo značajnost nastavka istraživanja i bioaktivnih komponenti lista ružmarina s ciljem potpunijeg objašnjenja i potencijalne primjene u industriji kozmetike ili farmaceutskoj industriji. Na temelju dobivenih rezultata daljnja istraživanja će se usredotočiti na detaljniju procjenu bioaktivnih komponenti biljke ružmarin.