Original scientific paper

https://doi.org/10.46419/vs.53.1.9

Učinkovitost sljedeće generacije sekvenciranja u dijagnostici bakterijskih zoonoza

Sanja Duvnjak ; Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
Željko Pavlinec orcid.org/0000-0001-7128-4280 ; Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
Robert Vaser ; Faculty of Electrical Engineering and Computing, Zagreb, Croatia
Krešimir Križanović ; Faculty of Electrical Engineering and Computing, Zagreb, Croatia
Mile Šikić ; Genome institute Singapore, A*STAR, 60 Biopolis St, Singapore
Maja Zdelar-Tuk orcid.org/0000-0002-9349-6177 ; Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
Irena Reil orcid.org/0000-0002-2198-557X ; Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
Silvio Špičić orcid.org/0000-0001-8317-5831 ; Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia

Abstract

Rod Brucella biološki je iznimno raznolik, ali genetski vrlo homogen rod bakterija te je već desetljećima znanstvenicima nepoznanica. Ove bakterije su veliki javno-zdravstveni problem, a osobito na Balkanu. Pravilno prepoznavanje i razumijevanje patogena ključan je korak u epidemiologiji i epizootiologiji bilo koje bakterijske vrste, čija identifikacija može biti izazovna, osobito u slučaju zoonotskih vrsta. Cilj je ovog rada bio implementirati sekvenciranje četvrte generacije u tipizaciji 11 sojeva Brucella suis koje se čuvaju u našoj arhivi te ovu metodu usporediti s klasičnim i molekularnim metodama koje se trenutačno primjenjuju, a ne zasnivaju se na sekvenciranju. Klasično je biotipiziranje vrlo subjektivno i dalo je podvojene rezultate za 3 soja. Od molekularnih metoda koristili smo višestruku lančanu reakciju polimerazom (engl. Polymerase Chain Reaction, PCR) i polimorfizam duljine restrikcijskih fragmenata (engl. Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP) budući da niti jedna od metoda ne može zasebno identificirati i vrstu i biovar, a što je važno u slučaju Brucella suis infekcije. Vrsta i biovar svih sojeva uspješno su potvrđene i u skladu s rezultatima biotipizacije. Sekvenciranje sljedeće generacije (engl. Next Generation Sequencing, NGS) provodili smo na Oxford Nanopore MinION uređaju koji sekvencira duge lance DNK. Za sastavljanje genoma rabljeni su različiti algoritmi, a za identifikaciju i analizu rezultata MLST-a korišten je softver BioNumerics 8.0. MLST 21 je korišten za identifikaciju biovara i epidemiološku usporedbu ispitivanih sojeva. Genomi su bili veličine 3,2 Mb i sastavljeni u dva kromosoma. Analiza MLST 21 smjestila je naše sojeve u vrsne i biovarne skupine u skladu s drugim korištenim molekularnim testovima. Koliko je nama poznato, ovo je prva dokumentirana uporaba sekvenciranja dugih lanaca DNK u identifikaciji Brucella suis u jugoistočnoj Europi. Zaključujemo da je bakteriološka biotipizacija zastarjela i da je identifikacija biovara u ovom rodu, ovisno o domaćinu, netočna te da je molekularna karakterizacija uvijek sigurnija, brža i prikladnija opcija. MinION sekvenciranje pokazalo se kao vrlo pristupačno rješenje za određivanje vrste i biovara Brucella suis. Daljnja su istraživanja potrebna da bi se ustvrdilo koliko detaljne informacije o genomu može dati, imajući u vidu značajniji postotak pogreške prilikom sekvenciranja.

Keywords

Brucella suis, bruceloza, svinje, konji, Nanopore MinION, sekvenciranje sljedeće generacije

Hrčak ID:

261506

URI

https://hrcak.srce.hr/261506

Publication date:

17.6.2021.

Article data in other languages: english

Visits: 2.183 *