Antigen D smatra se jednim od najvažnijih eritrocitnih antigena jer je vrlo imunogen za osobe koje su D-negativne. Aloimunizacija na antigen D opaža se u 90% D-negativnih primatelja koji prime D-pozitivnu krv te u 1 od 6 D-negativnih trudnoća s D-pozitivnom novorođenčadi, ukoliko nije primijenjen Rh imunoglobulin (RhIG). (1)(2–3b) Anti-D protutijelo uzrokuje odgođenu hemolitičku transfuzijsku reakciju, a posebno je istaknuto u hemolitičkoj bolesti fetusa i novorođenčeta (HBFN). Stoga je određivanje antigena D i odabir D-podudarne krvi važan dio transfuzijske medicine.
Iako se određivanjem antigena D najčešće dobije jasno pozitivan, odnosno negativan rezultat, smetnje testiranja postoje u vrlo malog broja ljudi koji izražavaju D-varijante. Budući da su pojedine D-varijante klinički značajne, donošenje odluke o transfuzijskom liječenju ili o primjeni RhIG kod osoba s D-varijantom vrlo je složeno. Prije uvođenja molekularne dijagnostike, smetnje određivanja antigena D zaključivale bi se proglašavajući bolesnike i trudnice D-negativnima. Međutim, takav pristup uzrokovao je povećanu potrošnju dragocjenih zaliha D-negativne krvi i nepotrebno izlaganje žena RhIG. Novije spoznaje o D-varijantama i mogućnosti molekularne dijagnostike omogućuju kategorizaciju D-varijanti i drugačiji pristup u transfuzijskom liječenju i primjeni RhIG kod osoba s D-varijantom.
Antigen D pripada Rh sustavu, koji danas uključuje 55 antigena i jedan je od najpolimorfinijih sustava krvnih grupa. Rh proteini nose Rh antigene, ali su izraženi na eritrocitnoj membrani samo ukoliko je prisutan i RhAG protein. RhD protein izražava antigen D, dok RhCcEe protein nosi antigene C/c i E/e. Polipeptidi D i CE imaju po 12 transmembranskih domena, a sastoje se od 417 aminokiselina koje se razlikuju u svega 36 aminokiselina. Antigen D zastupljen je u 85% ispitanika bijele populacije, u 95% ispitanika iz Afrike i u >99,5% ispitanika iz istočne Azije. (2) (2a)
Kloniranjem i sekvenciranjem gena definirana je molekularna osnova Rh sustava. Opisani su različiti genetski mehanizmi koji doprinose varijacijama antigena D, kao što su delecije, insercije, konverzije i mutacije gena. Molekularnu osnovu D-varijanti istraživali su Wagner i suradnici. (3) (2–3) Geni RH (RHD, RHCE) smješteni na 1. kromosomu koji kodiraju antigene D i CcEe su krajnje homologni jer su nastali duplikacijom, dok je gen koji kodira RhAG smješten na 6. kromosomu 40% homologan RH genima. Geni RH i gen RHAG sadrže po 10 egzona.
Za razliku od parcijalnih D-varijanti koje su većinom rezultat hibridnog gena u kojem je genskom konverzijom dio polipeptida RhD zamijenjen dijelom polipeptida RhCE u regijama izloženim na vanjskoj površini eritrocita, slabe D-varijante uglavnom proizlaze iz točkastih mutacija gena s promjenom jedne aminokiseline u transmembranskim i citosolnim regijama RhD polipeptida. Do danas je poznato >200 D varijanti. (4) (2a,b)
Tijekom vremena, mijenjali su se nazivi za serološki slabo izražen antigen D. Izraz „Du“, koji danas više nije u uporabi, se koristio za one antigene D koji su bili negativni u direktnoj aglutinaciji i pozitivni u indirektnom antiglobulinskom testu (IAT). Stariji nazivi „D-kategorija“ i „mozaični D“ također se više ne koriste, a novije izraze „parcijalni D“, „slabi D“ i „DEL“ danas zovemo zajedničkim imenom „D-varijante“. (5)
Učestalost D-varijante u bijeloj rasi je oko 0,2% do 1%. (6) Slabi D tip 1, 2 i 3 najčešće su D-varijante, s učestalosti oko 93% u bijeloj populaciji. (3) Klinički najznačajnija D-varijanta u bijeloj populaciji jest parcijalni antigen DVI koji je zastupljen u 0,02% ispitanika. (7) Učestalost D-varijanti je znatno veća u osoba afričkog podrijetla u odnosu na bijelu populaciju ili azijate. (2b)
Osobe nositelji D-varijante mogu stvoriti protutijelo anti-D ukoliko su bile izložene riziku imunizacije tijekom transfuzije, trudnoće ili transplantacije organa. Najčešći slabi D-tipovi 1, 2, 3 nisu povezani s RhD imunizacijom, što nije slučaj s drugim tipovima npr. 4,2 i 15. (6) Svi parcijalni D su rizični za RhD imunizaciju. Parcijalni DVI je najčešća D-varijanta u bijeloj populaciji povezana s RhD imunizacijom. (2) (2a) Objavljena je teška HBFN kod D-pozitivnog novorođenčeta DVI majke s anti-D. (8) U osoba afričkog podrijetla najčešće D-varijante koje su povezane s RhD imunizacijom jesu DIIIa i DAR. (2) Mnoge D-varijante su vrlo rijetke pa ne postoje podatci o RhD imunizaciji kod njihovih nositelja.
Razvoj smjernica
Pokušaji izrade smjernica u Republici Hrvatskoj za određivanje antigena D u bolesnika i trudnica sežu unatrag desetak godina, kada su u Transfuziološkom vjesniku objavljeni prvi algoritmi serološkog određivanja antigena D. (9) I dok su smjernice za određivanje antigena D za dobrovoljne darivatelje krvi jasne i jednoznačne, to nije slučaj sa smjernicama za određivanje antigena D u bolesnika i trudnica. U svijetu je tijekom proteklih dvadesetak godina objavljeno niz radova o određivanju antigena D. Do danas nisu izrađene jedinstvene smjernice, što je i logično zbog velikih populacijskih razlika, iako se stavovi svjetskih stručnjaka u tom području značajno približavaju. (10,11)
U proljeće 2018. godine pojavila se inicijativa Hrvatskog društva za transfuzijsku medicinu (HDTM) za održavanjem tečaja u cilju ujednačenog određivanja antigena D. Angažirani su stručnjaci u navedenom području iz Republike Hrvatske, koji su činili Radnu skupinu za donošenje smjernica. Do jeseni su proučili najnoviju literaturu te prikupili i analizirali višegodišnje rezultate rada u svojim transfuzijskim centrima/odjelima. Izrada smjernica nije financijski potpomognuta.
Na tečaju RhD – izrada novih smjernica testiranja bolesnika i trudnica i okruglom stolu održanom u Hrvatskom zavodu za transfuzijsku medicinu (HZTM) 9. studenog 2018. predložene su smjernice. Na telekonferenciji održanoj 24. siječnja 2019. i sastancima Radne skupine održanim 10. svibnja i 5. srpnja 2019. usuglašeni su stavovi stručnjaka za ovo područje i donesene su ove smjernice.
Kliničke smjernice HDTM namijenjene su prvenstveno specijalistima transfuzijske medicine, ginekolozima, pedijatrima, neonatolozima, anesteziolozima, internistima, liječnicima obiteljske medicine te svim liječnicima koji se u svom radu susreću s bolesnicima koji primaju krvne pripravke i donose odluku o primjeni imunoprofilakse RhIG. Pri izradi ovih smjernica Radna skupina se koristila sustavom GRADE (engl. Grading of Recommendation Assessment, Development and Evaluation) međunarodne skupine stručnjaka za donošenje smjernica utemeljenih na dokazima, koji uz snagu preporuke prikazuje i razinu dokaza. (12)
Povijest i ograničenja serološkog testiranja antigena D
Otkada su Kohler i Mildstein 1975. patentirali i razvili tehnologiju proizvodnje monoklonskih protutijela i za to zasluženo nagrađeni Nobelovom i Landsteinerovom nagradom, nekoliko skupina znanstvenika pokušalo je proizvesti monoklonska protutijela koja bi se koristila u području serologije krvnih grupa. Prva saznanja o tome prikazana su na Prvom simpoziju o monoklonskim protutijelima specifičnim za krvnu grupu (1st Symposium of blood group specific monoclonal antibodies) 1982. u Cambridgeu i kasnije na Prvoj međunarodnoj radionici (1st International workshop) 1987. u Parizu. Proizvodnja mišjih monoklonskih protutijela bila je vrlo uspješna, pogotovo za sustav krvnih grupa ABO i MN. Međutim, proizvodnja monoklonskih reagensa za antigen D je kasnila. Razlog tomu je proizvodni proces, koji je, zbog kompleksnosti antigena D, puno složeniji u odnosu na proces proizvodnje monoklonskih protutijela ABO. Dok su se za antigene ABO i MN koristili mišji hibridomi, za antigen D bilo je nužno transformirati humane limfocite B u stabilne stanične linije. Prvi monoklonski reagensi za određivanje antigena D prikazani su na Drugoj međunarodnoj radionici (2nd International workshop) u Lundu 1990. godine. (13)
Do pojave monoklonskih protutijela, u dijagnostici antigena D koristila su se poliklonska protutijela. Budući da su poliklonska protutijela imunoglobulini IgG razreda, za potrebe direktne aglutinacijske metode reagensi su se pripremali u visokoproteinskom mediju (22–30% albumin), a radi boljeg aviditeta dodavali su se potencijatori (metilceluloza, polivinilpirolidon (PVP), polibren, dekstran, fikol). Serum za proizvodnju poliklonskih reagensa s protutijelima anti-D dobivao se od imuniziranih trudnica ili putem imunizacije D-negativnih osoba s D-pozitivnim eritrocitima podudarnim u svim ostalim klinički značajnim antigenima. Nedostatci takvog načina dobivanja reagensa bili su ograničeni izvori, pitanje etičnosti, nekonzistentnost serija te potencijalna infektivnost, a korištenje visokoproteinskog medija rezultiralo je češćim lažno pozitivnim rezultatima, što zbog serumskih čimbenika, odnosno obloženosti eritrocita te zbog rouleaux fenomena uslijed duže inkubacije i evaporacije.
U odnosu na njih, prednost monoklonskih reagensa jest dostupnost u velikim količinama, neovisnost o izvoru, humaniji i etičniji pristup, prihvatljiva cijena, konzistentnost i stabilnost serija, reproducibilnost rezultata, jača reaktivnost u odnosu na poliklonske reagense te preciznost. Preciznost je uvjetovana uskom specifičnošću koja podrazumijeva vezivanje protutijela, koja su nastala iz jedinstvenog staničnog klona, za dio antigena kojeg nazivamo epitop. Svaki pojedini klon veže se isključivo na određeni i uvijek isti epitop. Monoklonska protutijela razreda IgM, kao i kemijski modificirana monoklonska protutijela razreda IgG, pripremaju se u niskoproteinskim medijima, što doprinosi rijetkim pojavama lažno pozitivnih rezultata. Zbog svojih su karakteristika monoklonski reagensi vrlo brzo u praksi zamijenili do tada korištene poliklonske reagense. (14) (2a,b)
Međutim, uvođenjem monoklonskih reagensa u određivanju antigena D javljaju se problemi u interpretaciji rezultata. Upravo uska specifičnost, karakteristična za monoklonske reagense, može uzrokovati razliku rezultata kod određivanja antigena D s malim brojem antigenih mjesta i promijenjenim epitopima. Kvantitativne i kvalitativne razlike antigena D sve više dolaze do izražaja. Javljaju se razlike rezultata u odnosu na poliklonske reagense, ali i unutar monoklonskih reagensa različitih staničnih linija ili istih staničnih linija, ali različitih faktora dilucije i/ili primijenjenih seroloških tehnika. (14)
Područje sive zone obuhvaća do 1% nejasnih rezultata. Nejasnoće se javljaju u smislu definiranja pozitivnog ili negativnog rezultata, odnosno procjene imunogenosti pojedinih D-varijanti i mogućnosti razvoja RhD aloimunizacije. (14)
Serološko određivanje Rh(D) krvne grupe (2,A)
Bolesnicima i trudnicama antigen D se određuje monoklonskim reagensima koji ne smiju otkrivati DVI-varijantu (anti-DVI-) direktnom aglutinacijskom metodom na sobnoj temperaturi. (9-11,15,16) Važno je naglasiti da se trudnicama i bolesnicima antigen D ne određuje metodom indirektnog antiglobulinskog testa (IAT), jer se na taj način želi izbjeći rizik da se uzorak s DVI+ kao i uzorak koji je DAT (direktni antiglobulinski test) pozitivan, a D-negativan, pogrešno interpretira kao D-pozitivan. (5,10,15,16)
Za određivanje krvne grupe ABO i Rh(D) poželjno je koristiti potpuno automatizirani sustav radi smanjenja rizika pogrešne interpretacije rezultata ili pogrešaka u prepisivanju rezultata. Serološko određivanje antigena D na potpuno automatiziranim sustavima dozvoljeno je s jednim monoklonskim IgM anti-DVI-reagensom. Svaki imunohematološki laboratorij, u skladu s uputama proizvođača reagensa i temeljem vlastite procjene rizika, donosi odluku o odabiru anti-DVI-monoklonskog reagensa i donosi odluku o definiranju granične vrijednosti (engl. cut-off). To većinom znači da se uzorci koji pokazuju jačinu aglutinacije >2+ u mikroaglutinacijskoj metodi ili >1+ metodom u epruveti proglašavaju Rh(D)-pozitivnim. S uzorcima koji pokazuju aglutinaciju 2+ ili slabiju u mikroaglutinacijskoj metodi, ili aglutinaciju 1+ ili slabiju metodom u epruveti, treba postupiti prema postupnicima. U odsutnosti potpuno automatiziranog sustava svaki uzorak se mora testirati u duplikatu i to s istim reagensom ili s dva različita monoklonska IgM anti-DVI-reagensa, sličnog afiniteta, radi smanjenja dvojbenih rezultata u otkrivanju D-varijanti. Ovakav način rada nužan je zbog smanjenja rizika unakrsne kontaminacije reagensa i proceduralne pogreške kada se radi ručno. (10)
U slučaju jasno negativnog i jasno pozitivnog rezultata nije potrebno daljnje testiranje. Uzorke s inicijalno dvojbenim rezultatima poželjno je uputiti na RhD genotipizaciju. (10,11) To su uzorci sa serološki slabim reakcijama, s neidentičnim rezultatima različitih anti-D-reagensa, kao i uzorci čiji se rezultati razlikuju u odnosu na prethodne rezultate.
RHD genotipizacija
Molekularno određivanje genotipova sustava krvnih grupa postalo je moguće nakon kloniranja i sekvenciranja gena koji kodiraju 38 sustava krvnih grupa za koje su poznati svi klinički važni genetički polimorfizmi. Svaki sustav krvnih grupa određuje jedan gen ili skupina povezanih homolognih gena u genskom lokusu. Većina polimorfizama krvnih grupa rezultat je SNP-ova (engl. single nucleotide polymorphism) koji dovode do aminokiselinskih zamjena u enzimu glikozil transferazi ili u domenama membranskih proteina eritrocita. (4)
RhD genotipizacija pomaže rješavanju dvojbenih rezultata serološkog određivanja antigena D te se sve više koristi u većini zapadnih zemalja kako bi se odredio RhD status bolesnika za transfuzijsko liječenje. Najveća dijagnostička vrijednost određivanja D-varijanti postiže se kombinacijom imunohematološkog serološkog i molekularnog testiranja. RhD genotipizacija je korisna za 0,5–4% bolesnika koji imaju promjene u genu RhD, a prevalencija D-varijanti i aleli se razlikuju ovisno o etničkim skupinama. (17,18) RhD genotipizacija omogućava određivanje najčešćih D-varijanti, koje bitno utječu na transfuzijsko liječenje i prema radu Đogić, et al. iz 2011. obuhvaćaju >85% D-varijanti u našoj populaciji, (19) a to su slabi D-tipovi 1, 2 i 3. Osobe koje su nositelji slabih D-tipova 1,2,3 tretiraju se kao D-pozitivne i kao primatelji krvi transfundiraju se s D-pozitivnim krvnim pripravcima. (19,25–28) Isto tako, trudnice nositelji slabih D-tipova 1, 2 i 3 ne trebaju dobiti RhIG. (5,10,11,15,16) (2b,B)
Postupnici određivanja Rh(D) krvne grupe
Temeljni dijagnostički postupak u određivanju Rh(D) krvne grupe jest serološki postupak koji se radi određivanjem antigena D u direktnoj aglutinacijskoj metodi s monoklonskim anti-DVI-reagensima. Ako u testiranom uzorku nema aglutinacije krvna grupa se proglašava Rh(D) negativnom, a ako je prisutna jaka aglutinacija krvna grupa se proglašava Rh(D) pozitivnom. U rješavanju serološki dvojbenih rezultata treba koristiti RhD genotipizaciju. Ukoliko je potrebno provesti transfuzijsko liječenje ili RhIG imunoprofilaksu prije završetka nalaza RhD genotipizacije, treba postupiti na slijedeći način. Za žene generativne dobi i osobe kod kojih očekujemo dugotrajno ili ponavljano transfuzijsko liječenje: „Rh(D) negativan“, a u napomenu: „D-varijanta. Potrebno je učiniti RhD genotipizaciju na slabi D-tip 1, 2, 3. Do tada postupiti kao s D-negativnim.“ (Figure 1). Za ostale: „Rh(D) pozitivan“, a u napomenu: „D-varijanta. Poželjno je učiniti RhD genotipizaciju na slabi D-tip 1, 2, 3. Može se transfundirati D-pozitivnim krvnim pripravcima.“ (Figure 2). Za novorođenčad: a) kada se Rh(D) krvna grupa novorođenčetu određuje zbog transfuzijskog liječenja novorođenčeta, određuje se samo direktnom aglutinacijskom metodom prema postupniku 1 (Figure 1). Oprez: Ukoliko se radi o RhD imuniziranoj majci krvni pripravak za novorođenče mora biti podudaran s majčinim protutijelima; b) kada se Rh(D) krvna grupa novorođenčetu određuje zbog odluke o davanju RhIG profilakse Rh(D) negativnoj rodilji (Figure 3), određuje se metodom direktne aglutinacije, a svakom RhD negativnom novorođenčetu mora se učiniti i pretraživanje na slabe D-varijante indirektnom metodom (u IAT-u) s anti-D-reagensom koji sadrži razred IgG. (10) (2–3,A) U slučaju pozitivnog rezultata indirektne aglutinacije na nalaz pisati: „Rh(D) negativan“, a u napomenu: „Serološki slaba D-varijanta. Majka treba primiti hiperimuni anti-D-gamaglobulin“, a u slučaju pozitivne Rh kontrole „Moguća serološki slaba D-varijanta. Majka treba primiti hiperimuni anti-D-gamaglobulin.“ Ograničenje testiranja u slučaju hemolitičke bolesti fetusa i novorođenčeta: potreban je oprez u određivanju antigena D novorođenčetu RhD imunizirane majke jer može doći do tzv. blokirajućeg fenomena (jako pozitivan DAT) u kojem majčina anti-D-protutijela oblažu eritrocite novorođenčeta i onemogućuju vezanje protutijela iz monoklonskog anti-D-reagensa, što dovodi do krive interpretacije nalaza (kao lažno negativan). Također, potreban je oprez i ukoliko je fetus liječen intrauterinim transfuzijama jer krvna grupa tada odražava krvnu grupu doze krvi.
Po završetku RhD genotipizacije definira se konačan nalaz Rh(D) krvne grupe. (11,16) U slučaju da se RhD genotipizacijom ne odrede slabi D-tip 1,2,3: prema uputi specijaliste transfuzijske medicine može se napraviti kompletna RhD genotipizacija (ostali klinički važni slabi D-tipovi i parcijalni D). Pri tome treba naglasiti da dostupni molekularni testovi ne obuhvaćaju sve poznate D-varijante i da su populacijski koncipirani te da u slučaju negativnog nalaza D-varijanti to uvijek ne isključuje prisutnost neke D-varijante koju test ne razlučuje ili se radi o posve novoj, koja još nije u bazi podataka. (2,A)
Upis rezultata u računalni program e-Delphyn
Za bolesnike i trudnice upućene na RhD genotipizaciju:
I. U slučaju hitnosti izdaje se nalaz krvne grupe prema postupniku 1 (slika 1) ili postupniku 2 (slika 2):
po završetku RhD genotipizacije, ustanova koja provodi RHD genotipizaciju nalaz RhD genotipa upisuje u e-Delphyn, u Medicinsku napomenu i u Upozorenja (kako bi nalaz svima u sustavu bio dostupan), a pisani nalaz šalje transfuzijskoj službi naručitelja;
temeljem nalaza RhD genotipa, transfuziolog iz laboratorija koji je uzorak uputio na RhD genotipizaciju uklanja validaciju s nalaza krvne grupe i u Napomenu za uzorak upisuje datum izmjene nalaza i jedno od niže navedenih tumačenja; u slučaju razlike rezultata RhD genotipa u odnosu na prethodno izdani nalaz potrebno je učiniti korekciju preko uslužnih alata u računalnoj aplikaciji e-Delphyn.
II. U slučaju da se može pričekati s izdavanjem nalaza krvne grupe, isti se definira tek po završetku RhD genotipizacije:
nalaz RhD genotipa upisuje u e-Delphyn, u Medicinsku napomenu i u Upozorenja ustanova koja radi RhD genotipizaciju, a pisani nalaz šalje transfuzijskoj službi naručitelja;
temeljem nalaza RhD genotipa, transfuziolog iz laboratorija koji je uzorak uputio na RhD genotipizaciju upisuje jedno od niže navedenih tumačenja.
Tumačenja po završetku RHD genotipizacije
a) za RhD genotip slabi D-tip 1, 2 ili 3:
„Rh(D) pozitivan“, a u napomenu npr.: „D-varijanta – slabi D-tip 1. Osobe nositelji ove D-varijante ne razvijaju RhD imunizaciju i proglašavaju se Rh(D) pozitivnim te se transfundiraju Rh(D) pozitivnim krvnim pripravcima, a trudnice ne zahtijevaju primjenu hiperimunog anti-D gamaglobulina.“
b) ako nije dokazan RhD genotip slabi D-tip 1, 2 ili 3; dokazan je slabi D-tip za koji se zna da može razviti RhD imunizaciju ili to nije poznato; ili je dokazan parcijalni D.
„Rh(D) negativan“, a u napomenu: „D-varijanta. Osobe nositelji ove D-varijante mogu razviti RhD imunizaciju i proglašavaju se Rh(D) negativnim te se transfundiraju Rh(D) negativnim krvnim pripravcima, a trudnice trebaju primiti hiperimuni anti-D-gamaglobulin.“
RhD imunizacije kod osoba s D-varijantom
Kod sumnje da se radi o D-varijanti s RhD imunizacijom, potrebno je napraviti RhD genotipizaciju. Kako bismo isključili reaktivnost zbog antieritrocitnih autoprotutijela (autoanti-LW, autoanti-D), kod pozitivnog DAT-a, potrebno je i dodatno testiranje koje uključuje autoadsorpciju i eluciju protutijela.
Potvrđenu RhD imunizaciju kod osoba s D-varijantom treba prijaviti u HZTM, Referentni centar za transfuzijsku medicinu Ministarstva zdravstva u RH. Takvo centralno prikupljanje podataka o RhD imunizacijama kod nositelja D-varijanti omogućit će uvid o njihovoj učestalosti i značajnosti.
Podatci o RhD imunizacijama kod D-varijanti bit će prikazani u Transfuziološkom vjesniku jednom godišnje.
Fetalna RhD genotipizacija
Kod Rh(D) negativnih trudnica, vodeći uzrok HBFN-a je nepodudarnost Rh(D) krvne grupe između majke i fetusa, pri čemu dolazi do imunizacije majke i prijelaza majčinih anti-D-protutijela kroz posteljicu. (20) Dokazano je da se fetalna genomska cffDNA koja potječe iz trofoblasta fetusa već nakon 4 tjedna gestacije nalazi u majčinoj plazmi (3%) i njen udio raste do 6% pred porod, nakon čega se uklanja iz majčinog krvotoka pa prethodne trudnoće ne interferiraju. (21) (2 B) Na taj način omogućeno je prijenatalno određivanje fetalnog RhD genotipa neinvazivnom metodom iz uzorka majčine plazme. Vrlo mali udio fetalne cffDNA u odnosu na majčinu DNA i velike intraindividualne varijacije u njenom izlučivanju u majčinu plazmu predstavljaju metodološki izazov koji se rješava posebnom provedbom izolacije cffDNA i vrlo osjetljivom metodom lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (engl. real-time polymerase chain reaction) uz ispitivanje bar dviju regija RhD gena. (22–24) Kao i svaka analitička metoda, tako i određivanje prijenatalnog fetalnog RhD genotipa ima „sivu zonu“ rezultata kao i lažno negativne i lažno pozitivne rezultate, u malom postotku. U slučaju nemogućnosti razlučivanja radi li se o RhD pozitivnom ili negativnom nalazu fetalnog genotipa, trudnica se poziva na vađenje novog uzorka u određenom vremenu kako bi se molekularno testiranje ponovilo („siva zona“). Lažno negativni rezultati koji znače da je fetalni RhD genotip utvrđen kao negativan, a dijete po rođenju je RhD pozitivno, događaju se uglavnom uslijed bioloških varijacija izlučivanja cffDNA u majčinu plazmu. Suprotno tomu, lažno pozitivni rezultati mogući su zbog kontaminacije uzoraka, kontaminacije reagensa ili humane/mehaničke greške u radu, intrauterine smrti blizanca („vanishing twins”), placentarnog mozaicizma i naravno zbog prisutnosti D-varijanti ili kod majke ili kod oca. Metode za određivanje prijenatalnog fetalnog RhD genotipa prethodno se pomno validiraju/verificiraju te se prati točnost rezultata i nekorektni rezultati prijavljuju kao incidenti te se detaljno istražuje izvor greške. Najnovija britanska metastudija brojnih referencija određivanja fetalnog RhD genotipa pokazuje da je stopa lažno negativnih bila 0,34% (95% CI 0,15 – 0,76), a stopa lažno pozitivnih 3,86% (95% CI 2,54 – 5,82). (25)
Ako se radi o RhD imuniziranoj trudnici, prijenatalnu fetalnu RhD genotipizaciju neinvazivnom metodom iz majčine plazme moguće je učiniti već nakon 16. gestacijskog tjedna u HZTM-u, te prema nalazu odrediti učestalost i način praćenja trudnice; trudnica s RhD negativnim fetusom ne zahtijeva intenzivan nadzor trudnoće, kao niti RhIG profilaksu.
Na tečaju RhD – izrada novih smjernica testiranja bolesnika i trudnica dogovoreno je da se RhD imuniziranim trudnicama ponudi mogućnost neinvazivnog određivanja prijenatalnoga fetalnog RhD genotipa iz majčine plazme nakon 16. tjedna gestacije u HZTM-u, uz napomenu na nalazu serološkog imunohematološkog ispitivanja: „Preporuka: učiniti fetalnu RHD genotipizaciju iz majčine plazme nakon 16. tjedna gestacije“.
Fetalna RhD genotipizacija kod trudnica s RhD imunizacijom nužna je radi procjene ugroženosti fetusa/novorođenčeta od HBFN-a i određivanja dinamike ginekološkog nadzora te planiranja prijenatalnog transfuzijskog liječenja odnosno poroda i poslijenatalnog liječenja. (26–29) (2a, A)
Preporuka za provođenje rutinske prijenatalne RhIG profilakse u razvijenim zemljama jest u 28. gestacijskom tjednu davanjem 1250–1500 IU anti-D IgG ili u 28. i 34. gestacijskom tjednu 625 IU anti-D IgG. Osim rutinske prijenatalne RhIG profilakse potrebno je provoditi RhIG profilaksu unutar 72 sata nakon imunizacijskog događaja (pobačaj, amniocenteza, kordocenteza, porod, trauma abdomena, mola hydatidosa, vanmaternična trudnoća). (26–29) (2a, A)
Metodom neinvazivnog određivanja fetalnog RhD genotipa sprječava se nepotrebna imunoprofilaksa za oko 40% D-negativnih majki koje nose D-negativne fetuse, a za one koje nose D-pozitivne fetuse omogućava se ciljana prijenatalna RhIG profilaksa, čime se smanjuje broj RhD imunizacija. Prednost je za trudnice manji broj ginekoloških i ultrazvučnih kontrola te imunohematoloških obrada, kao i manje invazivnih amniocenteza, što bitno smanjuje stres kod trudnica i značajno smanjuje rizik od gubitka fetusa.
Fetalna RhD genotipizacija kod D-negativnih RhD neimuniziranih trudnica radi se rutinski sveobuhvatno u Danskoj, Nizozemskoj, Finskoj i Švedskoj u okviru nacionalnog programa prijenatalne zaštite trudnica i temeljem rezultata testa odlučuje se o primjeni RhIG. Neke države provode fetalnu RhD genotipizaciju regionalno (Belgija, Velika Britanija, Češka, Francuska, Njemačka), a ostale zemlje je provode na zahtjev kliničara, baš kao i u HZTM gdje se metoda primjenjuje kao dijagnostički test od 2012. godine. U Hrvatskoj se ne primjenjuje rutinska prijenatalna RhIG profilaksa, a kada se odluči o njenom uvođenju, fetalna RhD genotipizacija trebala bi biti značajan alat u probiru D-negativnih trudnica koje zaista trebaju primiti RhIG.
Uzorci krvi za RhD genotipizaciju
Uzorak za testiranje RhD gena kod D-varijanti:
Na uputnici navesti: „traži se: Genotipizacija slabi D-tip 1,2,3“.
Uzorci za prijenatalnu fetalnu RhD genotipizaciju iz majčine plazme:
2 Vacutainer epruvete s K- EDTA (ljubičasti čep) od 6 mL, ako se dostavljaju u HZTM u roku 8 h;
kada se uzorci krvi šalju unutar 48 h iz drugih dijelova Hrvatske, moraju biti uzeti u 2 PPT epruvete s gelom od 8,5 mL i centrifugirani prije transporta tijekom 10 minuta na 2500 okretaja/min.
Na uputnici navesti: „traži se: Fetalna RhD genotipizacija iz majčine plazme“.