Multipli mijelom (skr. MM) zloćudna je novotvorina koja nastaje klonskom proliferacijom plazmatskih stanica. Iako je to i dalje neizlječiva bolest, u posljednjih 10-ak godina bilježi se znatan napredak u liječenju. Liječenje se temelji na inhibitorima proteasoma (bortezomib) i/ili imunomodulatornim lijekovima (talidomid), a u bolesnika mlađih od 70 godina i na transplantaciji autolognih krvotvornih matičnih stanica. Kod relapsa ili refraktorne bolesti primjenjuju se monoklonska protutijela i/ili inhibitori proteasoma nove generacije (karfilzomib, iksazomib) i imunomodulatori nove generacije (lenalid, pomalidomid). (1) Monoklonska protutijela trenutačno su najispitivaniji oblik liječenja u onkologiji i prominentna su skupina novih agensa s jedinstvenim mehanizmom djelovanja. U liječenju MM-a monoklonsko protutijelo anti-CD38 usmjereno je na protein mijelomskih stanica CD38, s posljedičnom inhibicijom rasta i smrti stanice višestrukim mehanizmima djelovanja uključujući i Fc-efektorske mehanizme. (2)
Daratumumab (skr. DARA) prvo je monoklonsko protutijelo za liječenje MM-a koje je nakon višegodišnjih kliničkih istraživanja u studenome 2015. godine odobrila američka Agencija za hranu i lijekove (engl. Food and Drug Administration – FDA), a u svibnju 2016. godine i Europska agencija za lijekove (engl. European Medicines Agency – EMA. (3–6) U Hrvatskoj se primjenjuje od lipnja 2019. godine, i to u kombinaciji s lenalidomidom i deksametazonom ili bortezomibom i deksametazonom, za liječenje odraslih bolesnika s MM-om koji su primili barem jednu prethodnu terapiju. Inicijalno se odobravaju 4 ciklusa liječenja, a nastavak liječenja moguć je samo kod pozitivnoga tumorskog odgovora na provedeno liječenje (potpuni odgovor, vrlo dobar djelomičan odgovor, djelomičan odgovor ili stabilna bolest). Daratumumab se najčešće primjenjuje jedanput na tjedan u prva dva mjeseca, a ako bolesnik dobro odgovara na terapiju, svaka dva tjedna iduća četiri mjeseca i zatim jedanput na mjesec do progresije bolesti. (7)
Budući da je anti-CD38 humano monoklonsko IgG1κ-protutijelo koje se specifično veže za protein CD38 izražen na eritrocitima, uzrokuje smetnje pri testovima prijetransfuzijskog ispitivanja koji se izvode u indirektnom antiglobulinskom testu (skr. IAT): pretraživanju, odnosno identifikaciji antieritrocitnih protutijela i križnoj reakciji. Vezanjem za protein CD38 monoklonsko protutijelo anti-CD38 uzrokuje panreaktivnost s testnim eritrocitima čime se teže otkrivaju prisutna antieritrocitna aloprotutijela. Katkad uzrokuje pozitivan direktni antiglobulinski test (skr. DAT), ali ne uzrokuje smetnje u određivanju krvne grupe (ABO/D). (8,9)
Radi rješavanja smetnja prijetransfuzijskog ispitivanja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38 potrebno je primijeniti specifične postupke imunohematološkog ispitivanja kojima se često odgađa transfuzijsko liječenje. Specifični postupci primijenjeni samostalno ili u kombinaciji uključuju: obradu testnih eritrocita tiolima ili tripsinom, pretraživanje antieritrocitnih protutijela eritrocitima iz pupkovine, neutralizaciju anti-CD38 topljivim rekombinantnim CD38 (sCD38) ili primjenu antiidiotipskih protutijela anti-CD38 i transfuzijsko liječenje eritrocitnim pripravcima podudarnima u antigenu nakon određivanja fenotipa odnosno genotipa bolesnika odnosno darivatelja. S obzirom na ograničenja specifičnih postupaka imunohematoloških ispitivanja, potrebno je odabrati metodu koja najbolje odgovara mogućnostima i potrebama transfuzijskog laboratorija. Dodatna ograničenja primjene ovih metoda jesu vremenski zahtjevno i složeno testiranje te nedostupnost reagensa u mnogim laboratorijima. Odabir postupka ovisi o dostupnosti i cijeni reagensa te o znanju i iskustvu djelatnika u laboratoriju. (10,11)
U ovom su radu prikazani postupci prijetransfuzijskog ispitivanja i transfuzijskog liječenja bolesnika liječenih DARA-om koji su uspostavljeni u Kliničkom zavodu za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju KBC-a Zagreb. Retrospektivno su analizirana naša iskustva u rješavanju smetnja prijetransfuzijskog ispitivanja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38 i u transfuzijskom liječenju bolesnika liječenih DARA-om.
Ispitanici i metode
U istraživanju su analizirani bolesnici s MM-om koji su od lipnja do listopada 2019. godine liječeni DARA-om u Zavodu za hematologiju Klinike za unutarnje bolesti Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, KBC Zagreb. Prijetransfuzijsko ispitivanje prije primjene DARA-e i poslije nje provedeno je na Odjelu za transfuzijsku medicinu Kliničkog zavoda za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, KBC Zagreb.
Pri planiranju liječenja DARA-om u transfuzijsku službu poslan je uzorak za prijetransfuzijsko ispitivanje uz najavu planiranog datuma početka primjene DARA-e. Iz uzorka krvi izvađenoga prije primjene DARA-e određena je krvna grupa (ABO/D), pretražena su antieritrocitna protutijela, proveden je DAT, određeni su rezusni (Rh) fenotip i klinički najvažniji eritrocitni antigeni iz sustava krvnih grupa Kell, Kidd, Duffy i MNS. Za određivanje krvne grupe primijenjene su kartice Blood Grouping Reagents anti-A/anti-B/anti-D/Ctrl/A1/B i 0,8%-tni testni eritrociti Affirmagen A1/B, za DAT kartice Polyspecific, anti-IgG, -C3d, za pretraživanje antieritrocitnih protutijela kartice Polyspecific i 0,8%-tni dvostanični testni eritrociti Selectogen I i II, a eritrocitni antigeni određeni su primjenom seruma specifičnih za antigen (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ, SAD).
Za pouzdanost određivanja fenotipa morali su biti zadovoljeni ovi uvjeti: bolesnik posljednja 3 mjeseca nije transfundiran i DAT je negativan (zbog određivanja eritrocitnih antigena u IAT-u). Ako nisu bili zadovoljeni uvjeti za određivanje fenotipa, učinjena je genotipizacija. Određeni su geni iz sustava krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS, ali i geni drugih sustava krvnih grupa kao što su Dombrock, Lutheran, Cartwright, Diego, Vel, Knops i Colton. Genotip je određen metodom PCR-a, u stvarnom vremenu, s pomoću kompleta RBC-Fluogene vERYfy eXtend (Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Njemačka).
Nakon imunohematološke obrade u medicinsku dokumentaciju bolesnika upisana su upozorenja o planiranom liječenju DARA-om, rezultati prijetransfuzijskog ispitivanja i specifični zahtjevi za transfuzijsko liječenje eritrocitnim pripravcima podudarnima u antigenu.
Iz uzoraka krvi izvađenih nakon primjene DARA-e pretražena su antieritrocitna protutijela i određen je DAT. Pri potrebi za transfuzijskim liječenjem nakon primjene DARA-e u transfuzijsku službu poslan je uzorak za prijetransfuzijsko ispitivanje u kojem su standardnim testiranjem pretražena antieritrocitna protutijela i napravljene križne reakcije. Za transfuzijsko su liječenje, prema raspoloživosti, odabrani eritrocitni pripravci podudarni prema klinički najvažnijim antigenima iz sustava krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS. Zatim su za test pretraživanja antieritrocitnih protutijela i za križnu reakciju primijenjeni specifični postupci imunohematološkog ispitivanja koji su uključivali: obradu eritrocita ditiotreitolom (skr. DTT) koncentracije 0,2 M, prema metodi koju su opisali Roback i suradnici, (12) i neutralizacijski test uz primjenu reagensa DaraEx u skladu s uputom proizvođača (Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Njemačka), ako je reagens bio dostupan. Za pretraživanje antieritrocitnih protutijela obrađeni su testni eritrociti, a za križnu reakciju eritrociti doze. Predloženi postupci prijetransfuzijskog ispitivanja prije primjene monoklonskog protutijela anti-CD38 prikazani su naFigure 1, a postupci tijekom njegove primjene i poslije nje naFigure 2. Postupci pri transfuzijskom liječenju tijekom primjene monoklonskog protutijela anti-CD38 i 6 mjeseci poslije nje prikazani su naFigure 3.
Za sva testiranja prije i poslije primjene DARA-e primijenjeni su svježi uzorci krvi izvađeni na antikoagulans etilendiamintetraoctenu kiselinu. Pretraživanje antieritrocitnih protutijela obavljeno je naknadno standardnim testiranjem i primjenom specifičnih postupaka imunohematoloških ispitivanja za uklanjanje smetnja monoklonskih protutijela anti-CD38: obradom eritrocita DTT-om 0,2 M i reagensom DaraEx. Da bi se usporedila učinkovitost specifičnih postupaka za uklanjanje smetnja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38, testiranja su naknadno provedena paralelno na 10 uzoraka plazme istih bolesnika, pohranjenih na -30 °C, koji su prethodno otopljeni i centrifugirani na 3000 okretaja/min.
Za statističku obradu podataka primijenjene su deskriptivne statističke metode. Podatci o transfuzijskom liječenju dobiveni su iz transfuzijskog informatičkog sustava. Vrijeme potrebno za transfuzijsko liječenje bolesnika liječenih DARA-om izračunano je razlikom vremena između primanja zahtjeva za transfuzijsko liječenje i izdavanja eritrocitnog pripravka. Transfuzijske reakcije bolesnika liječenih DARA-om provjerene su pregledom prijava transfuzijskih reakcija u medicinskoj dokumentaciji.
Rezultati
U istraživanju je analizirano 10-ero bolesnika liječenih DARA-om, 6 muškaraca i 4 žene u dobi od 43 do 78 godina. Prosječna doza primljenog lijeka po bolesniku iznosila je 14,8 mg/kg. U jednog bolesnika liječenje je bilo prekinuto zbog neželjenih reakcija na DARA-u unatoč primljenoj premedikaciji.
U transfuzijsku službu upućeno je 5 od 10 (50%) uzoraka prije primjene DARA-e. DAT je bio negativan u 4 (80%) uzoraka, a testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela bili su negativni u svim uzorcima prije primjene DARA-e. Fenotip je bio određen u 7 (70%) bolesnika, a u 3 (30%) bolesnika bio je određen genotip jer nisu bili zadovoljeni uvjeti za određivanje fenotipa.
U svim uzorcima upućenima u transfuzijsku službu nakon primjene DARA-e testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela bili su pozitivni. DAT je bio pozitivan u petero (50%) bolesnika nakon primjene DARA-e, od kojih je u njih četvero prije primjene lijeka bio negativan, u jednog bolesnika pozitivan, a kod ostalih nije određen.
Transfuzijsko liječenje eritrocitnim pripravcima kod bolesnika liječenih DARA-om prikazano je naTable 1. U transfuzijsku je službu za 9-ero bolesnika upućeno 30 zahtjeva za transfuzijsko liječenje eritrocitnim pripravcima nakon primjene DARA-e. Od ukupno traženih 58 doza koncentrata eritrocita transfundirane su 43 (74,1%) doze. Od toga je prema najvažnijim antigenima u sustavima krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS podudarno bilo 38 (88,4%) doza, u sustavima krvnih grupa Rh, Kell i Kidd podudarale su se 3 (7,0%) doze, dok su dvije (4,7%) doze koncentrata eritrocita bile podudarne samo prema sustavima Rh i Kell. Medijan vremena od primanja zahtjeva do izdavanja krvi za transfuzijsko liječenje iznosio je 8 sati i 21 minutu (raspon 1 sat i 32 min do 171 sat i 15 min), a u 8 (26,6%) zahtjeva transfuzijsko liječenje bilo je odgođeno za više od 24 sata zbog traženja eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu. Samo je jedan zahtjev bio hitan, ali je nakon razgovora s liječnikom zaduženim za bolesnika transfuzijsko liječenje bilo odgođeno i taj je bolesnik bio transfundiran za 10 sati i 45 minuta, dok su ostali zahtjevi bili upućeni redovitim postupkom. Nije zabilježena nijedna transfuzijska reakcija.
Ukupno je napravljeno 30 testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela i 53 križne reakcije. Rezultati svih testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križnih reakcija standardnim su testiranjem kod bolesnika liječenih DARA-om bili pozitivni. Jačina reakcija najčešće je bila 2+ (od 1+ do 2+). Testni eritrociti obrađeni su DTT-om 0,2 M nakon čega je 12 (40,0%) testova pretraživanja bilo pozitivno. Od 13 testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela u kojima su testni eritrociti obrađeni reagensom DaraEx, tri (23,1%) su bila pozitivna (Table 2). Eritrociti svih doza također su obrađeni DTT-om 0,2 M nakon čega je 21 (39,6%) križna reakcija bila pozitivna. Od 23 doze čiji su eritrociti obrađeni reagensom DaraEx, pet (21,7%) ih je bilo pozitivno (Table 3). Jačina reakcija kod pozitivnih testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križnih reakcija poslije primjene specifičnih postupaka imunohematoloških ispitivanja bila je smanjena i najčešće je bila slabo pozitivna.
NT = nije testirano / not tested; POZ/POS = pozitivno / positive; NEG = negativno / negative, DTT = ditiotreitol / dithiothreitol
NT = nije testirano / not tested; POZ/POS = pozitivno / positive; NEG = negativno / negative, DTT = ditiotreitol / dithiothreitol
Bolesnicima koji su nakon primjene obaju postupaka ili, zbog nedostatka reagensa, samo jednoga specifičnog postupka imali pozitivne testove pretraživanja antieritrocitnih protutijela (0% poslije primjene obaju postupaka odnosno 26,7% nakon primjene samo postupka DTT-om) ili križnu reakciju (1,9% poslije primjene obaju postupaka odnosno 28,3% nakon primjene samo postupka DTT-om) nije obavljena identifikacija antieritrocitnih protutijela s obzirom na to da je, prema transfuzijskoj anamnezi (bolesnici nisu transfundirani), rezultatima prije primjene DARA-e (negativni testovi prijetransfuzijskog ispitivanja) i rezultatima imunohematološkog ispitivanja poslije primjene DARA-e (doza podudarna u svim važnim antigenima, nepodudarna križna reakcija, a negativni testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela i isključen pozitivan DAT doze), zaključeno da se radi o lažno pozitivnim rezultatima testiranja zbog primjene DARA-e u kojima su specifični postupci rješavanja smetnja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38 bili neučinkoviti. Testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križne reakcije nakon obrade eritrocita DTT-om i reagensom DaraEx nisu bili pozitivni kod tih bolesnika.
Naknadnim pretraživanjem antieritrocitnih protutijela iz pohranjenih plazmatskih uzoraka, svi su testovi standardnim testiranjem bili pozitivni. Nakon obrade testnih eritrocita DTT-om 0,2 M četiri su testa (40%) bila pozitivna, a poslije obrade testnih eritrocita reagensom DaraEx dva su (20%) testa pretraživanja antieritrocitnih protutijela bila pozitivna (Table 4).
POZ/POS = pozitivno / positive; NEG = negativno / negative, DTT = ditiotreitol / dithiothreitol
Rasprava
U ovom su istraživanju utvrđene smetnje prijetransfuzijskog ispitivanja u testovima pretraživanja antieritrocitnih protutijela i u križnim reakcijama na svim testiranim uzorcima bolesnika s MM-om nakon primjene DARA-e, što je u skladu s drugim istraživanjima o prijetransfuzijskom ispitivanju poslije primjene DARA-e. (8,9) Zbog liječenja monoklonskim protutijelom anti-CD38 dolazi do vezanja tog protutijela za protein CD38 na površini eritrocita, što uzrokuje panreaktivnost u testovima prijetransfuzijskog ispitivanja u IAT-u: pretraživanju, odnosno identifikaciji antieritrocitnih protutijela i križnoj reakciji. Osim na eritrocitima, protein CD38 izražen je i na drugim limfoidnim i mijeloidnim stanicama, kao i na nekim nehematopoetskim stanicama. Rezultati analize proteina CD38 metodom Western blot pokazuju povećan izražaj CD38 na membrani eritrocita bolesnika s tumorom, a slabiji izražaj na eritrocitima zdravih osoba. (13) Iako su reakcije s monoklonskim protutijelom anti-CD38 slične onima koje uzrokuju autoprotutijela, ostali testovi kao što su autokontrola, DAT i eluat često su negativni, što može dovesti do pogrešnog zaključka da se radi o aloprotutijelu na antigen velike učestalosti.
Monoklonsko protutijelo anti-CD38 uzrokuje panreaktivnost s testnim eritrocitima jačine od 1+ do 3+ u svim metodama koje se izvode u IAT-u (s fiziološkom otopinom, otopinom slabe ionske jakosti i polietilen glikolom), kao i u svim tehnikama (u epruveti, mikrostupcu ili čvrstoj fazi). Jačina reakcije ovisi o tome koliko je vremena prošlo od datuma primjene posljednje doze DARA-e, a smetnje u testiranju mogu trajati do 6 mjeseci nakon posljednje primjene lijeka. (14) U ovom su istraživanju smetnje prijetransfuzijskog ispitivanja u mikrostupcu, uz primjenu otopine slabe ionske jakosti u IAT-u, najčešće iznosile 2+ (od 1+ do 2+), a prijetransfuzijsko ispitivanje provedeno je u 6 mjeseci nakon primjene lijeka.
Zbog lažno pozitivnih rezultata pretraživanja antieritrocitnih protutijela teže se otkrivaju antieritrocitna aloprotutijela, a ako se ona previde, ugrožena je sigurnost transfuzijskog liječenja bolesnika. Iako je rizik od imunizacije u općoj populaciji svega 2 do 3%, (15), u hematološko-onkoloških bolesnika on iznosi oko 9% unatoč imunosupresivnim učincima kemoterapije koju primaju. (16) Jednom kada dođe do aloimunizacije, vjerojatnost stvaranja dodatnih aloprotutijela velika je. U dvadesetčetverogodišnjem retrospektivnom istraživanju koje je provedeno u Nizozemskoj 25 (21,7%) od 115 imuniziranih bolesnika stvorilo je dodatna aloprotutijela nakon transfuzije eritrocitnih pripravaka. Medijan intervala između otkrivanja prvog i dodatno stvorenog protutijela iznosio je 4 mjeseca. Dijagnoza i intenzitet liječenja nisu znatno utjecali na stvaranje dodatnih antieritrocitnih aloprotutijela. (17)
Nadalje, ovim je ispitivanjem utvrđen pozitivan DAT u gotovo polovine testiranih uzoraka nakon primjene DARA-e (u jednog bolesnika DAT je bio pozitivan prije primjene DARA-e). DAT može u početku primjene DARA-e biti pozitivan budući da u bolesnika s velikim izražajem CD38 dolazi do vezanja monoklonskog protutijela anti-CD38 na vlastite eritrocite. Njegovo uklanjanje djelovanjem makrofaga u slezeni praćeno je vrlo blagim padom hemoglobina (otprilike za 1,6 g/dL) i porastom broja retikulocita. (9) Osim što nakon primjene DARA-e dolazi do uklanjanja eritrocita s velikim izražajem CD38, smanjeni izražaj proteina CD38 kod bolesnika može se tumačiti supresijom koju uzrokuje monoklonsko protutijelo anti-CD38 usmjereno na antigen. (18) Smetnje u prijetransfuzijskom ispitivanju nisu specifične za DARA-u, nego su opažene i kod novih monoklonskih protutijela anti-CD38 koja su još u fazi istraživanja kao što su izatuksimab i MOR202. (19,20) S obzirom na to da se monoklonska protutijela anti-CD38 primjenjuju i za liječenje solidnih tumora i autoimunosnih bolesti, smetnje prijetransfuzijskog ispitivanja mogu se očekivati i kod te skupine bolesnika, a ne samo u bolesnika koji se liječe zbog MM-a. (21)
Obrada eritrocita ditiotreitolom pokazala se najprihvaćenijom metodom za rješavanje smetnja prijetransfuzijskog ispitivanja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38, a budući da je DTT 0,2 M lako dostupan i primjenjuje se u mnogim laboratorijima. (22) Njegovim djelovanjem cijepa se protein CD38 na membrani testnih eritrocita pa se monoklonsko protutijelo anti-CD38 ne može vezati za eritrocite i uzrokovati smetnje testiranja. Može se također primijeniti 6%-tni 2-aminoetilizotiuronij bromid (AET). (23) Neželjeni učinci primjene tih reagensa jesu uništavanje eritrocitnih antigena pojedinih sustava krvnih grupa (Kell, Dombrock, Indian, John Milton Hagen, Knops, Landsteiner-Wiener) i različito djelovanje na antigene iz sustava krvnih grupa Yt, Lutheran, Raph i Cromer. (24) Stoga postoji rizik da će primjenom tako obrađenih eritrocita biti propušteno otkrivanje protutijela iz navedenih sustava krvnih grupa. Budući da je u praksi od navedenih antigena najčešća aloimunizacija na K-antigen, transfuzijska reakcija zbog propuštenog protutijela anti-K može se spriječiti tako da se u transfuzijskom liječenju svih bolesnika negativnih na K-antigen, kao i onih nepoznatog antigenskog statusa, primijene K-negativni eritrocitni pripravci. Primjenom DTT-a 0,01 M, prema metodi iz Osake, uspješno se uklanjaju smetnje uzrokovane monoklonskim protutijelom anti-CD38 uz očuvanje K-antigena. (25) Višestrukim postupcima adsorpcije s neobrađenim eritrocitima, ali i s eritrocitima obrađenima reagensom ZZAP u čijem je sastavu DTT (DTT 0,2 M i 0,1%-tni papain), nisu se uspjele ukloniti smetnje testiranja uzrokovane monoklonskim protutijelom anti-CD38, najvjerojatnije zbog premalog izražaja antigena CD38 na eritrocitima za adsorpciju. (8) Tripsin nije u rutinskoj primjeni u laboratorijima, a i manje je učinkovit od DTT-a pri cijepanju proteina CD38 pa se vrlo rijetko primjenjuje za rješavanje smetnja prijetransfuzijskog ispitivanja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38. Tripsin također uništava ili oslabljuje reaktivnost s antigenima nekih sustava krvnih grupa (npr., MN, Lutheran, Chido/Rogers, Dombrock, Indian, JMH, Knops, Raph, Gerbich), ali ne djeluje na antigene sustava krvnih grupa Kell. Ostali proteolitički enzimi (npr., papain, bromelin ili ficin) u imunohematološkom su testiranju za primjenu kao dio postupka identifikacije antieritrocitnih protutijela.
Iako je obrada eritrocita DTT-om općeprihvaćena kao robustna i reproducibilna validirana metoda za uklanjanje smetnja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38, (22) u ovom je istraživanju obradom testnih eritrocita i eritrocita doze DTT-om 0,2 M lažno pozitivno bilo oko 40% križnih reakcija i testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela. Tijekom međunarodnog foruma Međunarodnog društva za transfuziju krvi (engl. International Society of Blood Transfusion – ISBT) o strategijama testiranja kod bolesnika liječenih monoklonskim protutijelom anti-CD38 prijavljena je 25 – 40%-tna neuspješnost ove metode s preostalim nespecifičnim reakcijama nakon obrade eritrocita DTT-om, uključujući i nesukladne rezultate kontrolnih testiranja, (26) što odgovara rezultatima našeg istraživanja.
Ako je pretraživanje antieritrocitnih protutijela DTT-om pozitivno, valja provesti identifikaciju protutijela panel-testom eritrocita obrađenih DTT-om, a pri transfuzijskom liječenju izdati specifične eritrocitne pripravke negativne na antigen, obrađene DTT-om i podudarne u IAT-u. Do danas nisu dostupni komercijalni testni eritrociti obrađeni DTT-om, a laboratoriji nemaju dostupne dovoljne količine eritrocita za pretraživanje ili identifikaciju specifičnosti antieritrocitnih aloprotutijela koje bi obradili DTT-om. Za tu se primjenu mogu skupljati i zamrzavati eritrociti darivatelja iz kojih se priprema jedanaestostanični panel-test eritrocita za određivanje specifičnosti antieritrocitnih protutijela, a eritrociti se mogu obraditi DTT-om ili AET-om, što je vrlo zahtjevno. U našem istraživanju, imunohematološkim ispitivanjem nakon primjene DARA-e, ni u jednog bolesnika nisu otkrivena antieritrocitna aloprotutijela u plazmi. U bolesnika kojima su poslije primjene specifičnih postupaka imunohematoloških ispitivanja testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križne reakcije bili pozitivni, a na temelju negativne transfuzijske anamneze, negativnih testova pretraživanja antieritrocitnih protutijela prije primjene DARA-e i rezultata nakon primjene tog lijeka u sklopu križne reakcije (doza podudarna u svim važnim antigenima, nepodudarna križna reakcija, a negativni testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela i isključen pozitivan DAT doze), zaključeno je da se radi o lažno pozitivnim rezultatima testiranja zbog neučinkovitosti specifičnih postupaka pa identifikacija protutijela nije provedena.
Neutralizacija monoklonskog protutijela anti-CD38 drugi je pristup blokiranju vezanja tog protutijela u plazmi bolesnika s pomoću testnih eritrocita, dodatka rekombinantnoga topljivog CD38 (sCD38) i protutijela anti-CD38. Iako su obje neutralizacijske metode vrlo učinkovite u sprječavanju vezanja monoklonskog protutijela anti-CD38, njihovi su nedostatci visoka cijena i nedostupnost. Primjenom rekombinantnog sCD38 neutralizira se monoklonsko protutijelo anti-CD38 u plazmi bolesnika. sCD38 komercijalno je dostupan, jednostavan, brz i učinkovit, ali njegov je nedostatak visoka cijena. Za blokiranje monoklonskog protutijela anti-CD38 mogu se primijeniti antiidiotipska protutijela koja se vežu specifično za anti-CD38, čime je blokirana reaktivnost tog protutijela s testnim eritrocitima. Antiidiotipska protutijela dostupna su samo za potrebe istraživanja. U ovom istraživanju za neutralizaciju monoklonskog protutijela anti-CD38 primijenjen je reagens DaraEx koji sadržava protutijelo anti-CD38 bez humane Fc-regije. Kad su eritrociti obrađeni reagensom DaraEx, protutijelo se veže na CD38 i blokira epitope na koje bi se vezao lijek DARA. Učestalost lažno pozitivnih rezultata ispitivanja iznosila je oko 20% za testove pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križne reakcije. Druga iskustva s primjenom reagensa DaraEx nisu dostupna u literaturi.
Primjenom eritrocita krvi iz pupkovine i eritrocita DARA-e koji su negativni na DAT i krvne grupe O omogućeno je prijetransfuzijsko ispitivanje bez smetnja testiranja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38, a izbjegnute su potreba obrade eritrocita tiolima ili primjena neutralizacijskih protutijela. Eritrociti iz pupkovine slabo izražavaju CD38, stoga se anti-CD38 neće vezati na njih, što se može iskoristiti za pretraživanje antieritrocitnih protutijela. Međutim, eritrociti krvi iz pupkovine nisu lako dostupni. Njihova je primjena praktički nemoguća u identifikaciji antieritrocitnih protutijela jer se komercijalni identifikacijski paneli teško mogu kontinuirano proizvoditi. Uz navedeno, ne izražavaju ili slabo izražavaju eritrocitne antigene P1 te one sustava krvnih grupa Lewis i Lutheran, čime ograničavaju njihovu učinkovitost pri isključivanju aloprotutijela. (10) Eritrociti bolesnika liječenih DARA-om, odnosno eritrociti DARA-e mogu se rabiti za prijetransfuzijsko ispitivanje jer su negativni na CD38- i DAT, a s obzirom na to da nakon primjene monoklonskog protutijela anti-CD38 može doći do vezanja na eritrocite s većim sadržajem proteina CD38 i hemolize.
Transfuzijsko liječenje bolesnika monoklonskim protutijelom anti-CD38 i prijetransfuzijsko ispitivanje
Potrebe za transfuzijom eritrocitnih pripravaka bolesnika liječenih monoklonskim protutijelom anti-CD38 kreću se u rasponu od 30 do 80%. (27) Pri transfuzijskom liječenju potrebno je odabrati eritrocitne pripravke podudarne u antigenu da bi se spriječila aloimunizacija i snizio rizik od budućih transfuzijskih reakcija. Iako je ovim pristupom spriječena imunizacija na klinički najvažnije eritrocitne antigene, postoji nekoliko nedostataka: 1. pripravci podudarni u antigenu nisu uvijek dostupni, 2. traženje eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu može odgoditi transfuzijsko liječenje, 3. nije isključena mogućnost imunizacije na ostale antigene. U transfuzijskom liječenju preporučuje se primjena eritrocitnih pripravaka podudarnih prema klinički najvažnijim antigenima u sustavima krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS, čime je rizik od hemolitičke transfuzijske reakcije snižen za otprilike 90%. (17) Dostupnost eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu ovisi o zahtjevu za antigenima negativnima na antigen za pojedinog bolesnika, a prema broju negativnih eritrocitnih antigena u bolesnika, kao i o udjelu darivatelja krvi kojima su određeni eritrocitni antigeni, uz opseg određivanja tih antigena. Genotipizacija osigurava veću točnost od fenotipizacije, a njezinom primjenom u automatiziranom testiranju darivatelja očekuje se kraće odgađanje transfuzijskog liječenja, kao i sniženje njegovih troškova. Za razliku od pretraživanja antieritrocitnih protutijela i križne reakcije koji imaju rok valjanosti, genotipizacijom će se omogućiti trajno izdavanje eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu. (28) Međutim, određivanje genotipa eritrocitnih sustava krvnih grupa znatno je skuplja pretraga koja se izvodi samo u specijaliziranim laboratorijima, što ju čini nedostupnijom. Genotipizacijom moraju biti obuhvaćeni najmanje geni iz sustava krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS, ali mogu se odrediti i geni drugih sustava krvnih grupa, što može pomoći u interpretaciji rezultata pri imunizaciji na druge eritrocitne antigene. Valja naglasiti da pri hitnom transfuzijskom liječenju koje je potrebno u roku od dva sata, redovito nema dovoljno vremena za specifične postupke prijetransfuzijskih ispitivanja. Podatci o prethodnim aloimunizacijama, rezultati fenotipiziranja ili genotipizacije u tim su slučajevima neprocjenjivo važni i tada treba primijeniti eritrocitne pripravke podudarne s prethodno određenim antigenima bolesnika. Naposljetku, klinička odluka o odabiru eritrocitnog pripravka podudarnog u antigenu ovisi o hitnosti zahtjeva za transfuzijsko liječenje i mogućnosti odabira takvog pripravka. (29) Pri hitnom transfuzijskom liječenju treba izdati eritrocitne pripravke podudarne s ABO/D, po mogućnosti prema najvažnijim eritrocitnim antigenima sustava krvnih grupa Rh i Kell.
Transfuzijsko liječenje bolesnika monoklonskim protutijelom anti-CD38 treba biti unaprijed najavljeno, a prije njegove primjene potrebno je poslati uzorke bolesnika u transfuzijsku službu na pretraživanje antieritrocitnih protutijela i određivanje eritrocitnih antigena. Liječnik koji skrbi za bolesnika treba biti upoznat s utjecajem monoklonskog protutijela anti-CD38 na prijetransfuzijsko ispitivanje. Pri transfuzijskom liječenju treba uzeti u obzir vrijeme potrebno za testiranje i osiguranje eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu. Na zahtjevu za transfuzijsko liječenje potrebno je naznačiti datum posljednje primjene monoklonskog protutijela anti-CD38. Međutim, ako transfuzijsko liječenje nije unaprijed najavljeno, a uzorci bolesnika prije i poslije primjene monoklonskog protutijela anti-CD38 nisu poslani u transfuzijsku službu, produljuje se vrijeme od primanja zahtjeva do izdavanja podudarnog pripravka. Stoga pri panreaktivnom protutijelu treba uvijek posumnjati na primjenu monoklonskog protutijela anti-CD38. Da bi se skratilo odgađanje transfuzijskog liječenja, laboratoriji trebaju imati uspostavljene protokole prijetransfuzijskog ispitivanja i sustav upozorenja za bolesnike liječene monoklonskim protutijelom anti-CD38.
Testiranja koja obuhvaćaju primjenu specifičnih postupaka nisu automatizirana i pri rutinskom su radu zahtjevna zbog trajanja obrade i potrebnog iskustva djelatnika u laboratoriju pa se provode ponajprije u referentnim laboratorijima. Osim uspostavljenih protokola, a da bi komunikacija među zdravstvenim djelatnicima bila pravodobna, ISBT preporučuje automatizaciju u komunikaciji kod bolesnika liječenih monoklonskim protutijelom anti-CD38. (26) Američka udruga banaka krvi (engl. American Association of Blood Banks – AABB) preporučuje obavještavanje transfuzijske službe o početku liječenja bolesnika DARA-om. (30) Proizvođač daratumumaba (Darzalex – Janssen Biotech Inc., Johnson & Johnson, Horsham, PA, SAD) također je svjestan smetnja u prijetransfuzijskom ispitivanju uzrokovanih DARA-om, stoga je izdao upute za zdravstvene djelatnike. (14) Iako monoklonsko protutijelo anti-CD38 otežava prijetransfuzijsko ispitivanje u transfundiranih bolesnika liječenih DARA-om, do danas nije prijavljen nijedan slučaj hemolitičke transfuzijske reakcije. (31) U našem istraživanju također nije bilo prijavljenih transfuzijskih reakcija, a bolesnici su prije transfuzijskog liječenja primili premedikaciju.
Prema međunarodnom forumu ISBT-a o strategijama testiranja kod bolesnika liječenih monoklonskim protutijelom anti-CD38, većina laboratorija (osam od 14) prijavljuje primjenu DTT-metode uz primjenu eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu, što je omogućeno fenotipiziranjem odnosno genotipiziranjem bolesnika (šest od osam). Pri negativnim testovima pretraživanja antieritrocitnih protutijela eritrocitni se pripravci izdaju prema protokolu T&S (engl. Type and Screen) bez križne reakcije. Neki se laboratoriji (tri od 14) oslanjaju samo na odabir eritrocitnih pripravaka podudarnih u antigenu. (26) U ovom istraživanju za prijetransfuzijsko ispitivanje prvo su odabrani klinički najvažniji eritrocitni pripravci podudarni s antigenom u sustavima krvnih grupa Rh, Kell, Kidd, Duffy i MNS (88,4%), a u nedostatku tih antigena s onima u sustavima krvnih grupa Rh, Kell i Kidd ili samo u sustavima Rh i Kell (11,6%). Zatim su eritrociti obrađeni DTT-om i reagensom DaraEx. S obzirom na to da smo ovim ispitivanjem utvrdili znatan udio lažno pozitivnih rezultata ispitivanja nakon primjene obaju specifičnih postupaka (oko 40% nakon obrade eritrocita DTT-om 0,2 M i oko 20% nakon primjene reagensa DaraEx), preporučujemo da se identifikacija antieritrocitnih protutijela bolesnika nakon primjene DARA-e, zbog velike zahtjevnosti procesa, provodi samo u prethodno imuniziranih i neimuniziranih transfundiranih bolesnika, kod kojih se ne može sa sigurnošću utvrditi radi li se o lažno pozitivnim rezultatima testiranja (npr., pozitivni testovi pretraživanja antieritrocitnih protutijela uz nepodudarnu križnu reakciju, pri odabiru doze koja nije podudarna u svim važnim antigenima, ako nije isključen pozitivan DAT doze).
Medijan vremena od primanja eritrocitnih pripravaka do njihova izdavanja iznosio je oko 8 sati. Chapuy i suradnici prikazali su da uz primjenu DTT-a medijan odgode transfuzijskog liječenja neimuniziranih bolesnika iznosi 2 sata, a aloimuniziranih bolesnika iznosi 4 sata. (22) Moguće je unaprijed obraditi eritrocite DTT-om, osobito u laboratoriju s više takvih zahtjeva, budući da se eritrociti mogu čuvati nekoliko dana nakon obrade, ovisno o primijenjenoj otopini za njihovu pohranu. (32) Opažanje hemolize za vrijeme skladištenja eritrocita obrađenih DTT-om može biti ozbiljan problem. U ovom je istraživanju opažena hemoliza eritrocita obrađenih DTT-om 0,2 M u fiziološkoj otopini nakon 3 dana skladištenja, dok su obrađeni eritrociti pohranjeni u Alseverovoj otopini skladišteni bez hemolize dulje od tri tjedna. Modificiranom metodom obrade eritrocita s pomoću smanjivanja udjela DTT-a 0,2 M na omjer 30: 25 (eritrociti: DTT) uklanjaju se smetnje uzrokovane monoklonskim protutijelom anti-CD38, a membrana obrađenih eritrocita nije oštećena obradom, što sprječava hemolizu tijekom njihova skladištenja. Time je omogućeno obrađivanje veće količine eritrocita i njihovo skladištenje do 33 dana, bez pojave hemolize. (33)
Zaključak
Liječenje monoklonskim protutijelom anti-CD38 uzrokuje panreaktivnost u testovima prijetransfuzijskog ispitivanja koji se izvode u IAT-u: pretraživanju, odnosno identifikaciji antieritrocitnih protutijela i križnoj reakciji. Panreaktivnost je posljedica vezanja monoklonskog protutijela anti-CD38 na protein CD38 na površini eritrocita, što pri standardnom testiranju onemogućuje otkrivanje antieritrocitnih aloprotutijela i osiguranje podudarne krvi za transfuzijsko liječenje. Radi uklanjanja smetnja testiranja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38, potrebno je primijeniti specifične postupke imunohematoloških ispitivanja.
Uvođenjem monoklonskog protutijela anti-CD38 u široku kliničku primjenu postoji opasnost da se podcijeni njegov utjecaj na postupke u transfuzijskoj službi, čime je ugroženo pravodobno izdavanje krvi, a zbog mogućih transfuzijskih reakcija ugrožena je i sigurnost transfuzijskog liječenja bolesnika. U ovom se radu oba specifična postupka, obrada eritrocita DTT-om 0,2 M i neutralizacijski test primjenom reagensa DaraEx, nisu pokazala dovoljno pouzdanima u rješavanju smetnja uzrokovanih monoklonskim protutijelom anti-CD38. Stoga je za transfuzijsko liječenje tih bolesnika nužno osigurati eritrocitne pripravke podudarne u antigenu. Budući da odabir takvog pripravka može odgoditi transfuzijsko liječenje, ustanove u kojima se liječe ovi bolesnici trebaju imati dogovorene protokole transfuzijskog liječenja pri primjeni DARA-e, koji uključuju pravodobnu komunikaciju svih zdravstvenih djelatnika uključenih u liječenje bolesnika. Trebaju biti uspostavljeni protokoli za rješavanje smetnja prijetransfuzijskog ispitivanja i odabir eritrocitnih pripravaka, a bolesnicima se preporučuje izdavanje iskaznica o liječenju monoklonskim protutijelom anti-CD38. Preporučuje se primjena DTT-a, jer je vrlo jeftin i dostupan, iako je testiranje dugotrajno i iziskuje iskustvo djelatnika. Druga je mogućnost primjena neutralizacijskih testova koji su brzi i jednostavni, ali im je cijena visoka i često su nedostupni. Primjena eritrocita krvi iz pupkovine i eritrocita DARA-e nije praktična jer su rijetko dostupni, a njihovo je kombiniranje zahtjevno. Pretpostavlja se da bi niža cijena neutralizacijskih testova i genotipizacije u budućnosti omogućila njihovu standardnu primjenu i dostupnost većini transfuzijskih služba.