Prethodno priopćenje
USPOREDBA KVALITETE RNA IZOLIRANE IZ TKIVA KALIFORNIJSKE PASTRVE (Oncorhynchus myhiss) PRIPREMLJENOG NA ČETIRI RAZLIČITA NAČINA
I. Vardić
E. Teskeredžić
Sažetak
Brza i precizna dijagnostika bolesti riba u uzgoju je važna radi pravodobnog sprječavanja velikih gubitaka. Tehnike molekularne biologije stoga nalaze veliku primjenu u području akvakulture. Prvi korak u takvim istraživanjima jest izolacija DNA ili RNA. Priprema tkiva za izolaciju RNA koja će poslužiti za daljnju analizu RT-PCR-om (reverzna transkripcija-lančana reakcija polimerazom) ključni je korak o kojem ovisi cijeli postupak analize. Svrha našeg istraživanja bila je usporediti kvalitetu i integritet RNA molekula izoliranih iz tkiva kalifornijske pastrve pripremljenog na četiri načina: svježe tkivo, smrznuto tkivo, tkivo fiksirano u metakarnu i uklopljeno u parafin i tkivo fiksirano u formalinu i uklopljeno u parafin. Izolirana RNA analizirana je elektroforetski na 1%-tnom, nedenaturirajućem agaroznom gelu. Njezina kvaliteta i integritet provjereni su u RT-PCR reakciji s početnicama za ß-aktin. Dodatno je provjerena i prisutnost virusa virusne hemoragične septikemije (VHS) i infektivne hematopoezne nekroze (IHN) iz ovako obrađenoga tkiva u RT-PCR reakciji s početnicama specifičnima za ove viruse. Visoku kvalitetu, integritet i količinu imala je RNA izolirana iz svježega i smrznutoga tkiva. RNA izolirana iz tkiva fiksiranog u metakarnu i uklopljenog u parafin bila je degradirana, ali je dala očekivane produkte u reakciji RT-PCR s početnicama za ß-aktin. Ovakvi produkti reakcije RT-PCR nisu dobiveni kada je rabljena RNA izolirana iz tkiva riba fiksiranog u formalinu i uklopljenog a parafin, što je a skladu s literaturnim podacima o agresivnom djelovanju formalina kao fiksatora na RNA u tkivu. Pregledane ribe nisu bile zaražene virusima VHSV i IHNV, što je bilo a skladu s anamnezom te kliničkim, patološkoanatomskim pregledom. Prema našim spoznajama, ovo je prva uspješna izolacija RNA iz tkiva riba fiksiranog u metakarnu i uklopljenog u parafin, a koja se dalje može rabiti u analizi RT-PCR. Metoda je jednostavna i relativno jeftina, a tkivo uklopljeno u parafin može se čuvati godinama, to je naša pretpostavka da bi se moglo upotrijebiti i za detekciju patogena (virusa) i za analizu genske ekspresije na razini mRNA, što ćemo pokušati potvrditi u našim budućim istraživanjima.
Ključne riječi
kalifornijska pastrva; metakarn; izolacija RNA; RT-PCR; VHSV; IHNV
Hrčak ID:
14715
URI
Datum izdavanja:
31.3.2004.
Posjeta: 1.572 *