Epigenetički biljezi u tumorima glave i vrata: posebni osvrt na tumore orofarinksa povezane s HPV-om

Tumori glave i vrata

Tumori glave i vrata (engl. HNC, head and neck cancer) obuhvaćaju tumore usta, nosa, grla, grkljana, ždrijela, sinusa ili žlijezda slinovnica te se u većini slučajeva odnose na tumore pločastih epitelnih stanica (engl. SCC, squamous cell carcinoma) sluznice dišnog trakta i oralne šupljine. Tumori glave i vrata su sedmi po učestalosti među tumorima i deveti po redu uzroka smrti kod ljudi diljem svijeta. Godišnje se procjenjuje oko 780.000 slučajeva te 350.000 slučajeva smrti od tumora glave i vrata, a petogodišnje preživljenje oboljelih je oko 40–50%. (7)

Čimbenici rizika razvoja tumora glave i vrata jesu izloženost karcinogenima, osobito pušenju duhana i konzumaciji alkohola, infekcija visokorizičnim tipovima HPV-a, poglavito HPV-16 te genetska predispozicija. Tumori glave i vrata su heterogeni, no često se dijele na dvije skupine: HPV-pozitivni (s boljom prognozom) i HPV-negativni tumori (s lošijom prognozom) (Table 1); novija istraživanja ukazuju na dodatnu genetsku subklasifikaciju HPV-negativnih tumora, od kojih neki također imaju bolju prognozu. (8) Nadalje, zna se da je HPV najčešći uzročnik karcinoma skvamoznih stanica orofarinksa. (1) Iako postoje sve čvršći dokazi da je HPV-pozitivni karcinom skvamoznih stanica glave i vrata povezan s boljim preživljenjem, za što se vjeruje da je zbog boljeg odgovora na kemoterapiju, specifični mehanizmi za ove poboljšane ishode i dalje su neistraženi. (9)

Gotovo svi tumori glave i vrata imaju promijenjenu ekspresiju gena uključenih u stanični ciklus. (10) Neograničeni replikativni potencijal stanica tumora glave i vrata temelji se na ukidanju signalnih puteva produkata tumor-supresorskih gena, poglavito p53 i retinoblastoma (pRB), što dovodi do ometanja regulacije staničnog ciklusa. Smatra se da je p53 najznačajniji tumor supresor, koji suzbija rast tumora putem aktivacije transkripcije ciljnih gena koji reguliraju brojne biološke procese. (11) U HPV-negativnim tumorima glave i vrata p53 je mutiran te na taj način inaktiviran u gotovo 60–84% slučajeva i stoga se gubi kontrola nad nizom staničnih procesa, što dovodi do imortalizacije pogođenih stanica, a potom transformacije (pretkanceroze) i, u konačnici, invazije. Nadalje, u HPV-negativnim tumorima učestale se kromosomske promjene i mutacije gena, za razliku od HPV-pozitivnih tumora. (1)

Gotovo svaki HPV-pozitivni tumor glave i vrata, od kojih su najčešći tumori orofarinksa, sadrži HPV-16, čiji se genom vrlo često ugrađuje u genom domaćina, odnosno u oko 50% slučajeva karcinoma, dok kod ostalih tumora ostaje u episomalnoj formi. Uslijed integracije virus gubi sposobnost daljnje reprodukcije, a stoga i infektivnost; ujedno gubi virusne gene koji negativno reguliraju ekspresiju onkogena E6 i E7 koji su na taj način pretjerano izraženi. Onkoproteini E6 i E7 igraju presudnu ulogu u kancerogenezi tumora glave i vrata. Naime, onkoprotein E6 uz pomoć ubikvitin-protein ligaze E6AP veže i razgrađuje p53 (12), dok E7 veže i razgrađuje pRb uz pomoć ubikvitin-Cullin-2 kompleksa. (13) Njihovo zajedničko djelovanje dovodi do pretjerane proliferacije stanica bez mogućnosti popravka oštećene DNA, imortalizacije stanica, genetske nestabilnosti, gubitka stanične polarnosti te konačne transformacije stanice domaćina, odnosno invazivnog karcinoma. (14)

Tumori glave i vrata kao heterogena skupina tumora podrijetlom s različitih sijela mogu pokazivati različito ponašanje koje histopatologija primarnog tumora nije u mogućnosti predvidjeti, ali može biti uočeno drugim metodama poput genetičkog ili epigenetičkog profiliranja gena. (15)

Metiliranje DNA

Metiliranje DNA je najčešća epigenetička i iznimno važna promjena uključena u razvoj tumora glave i vrata, poglavito orofarinksa. Naime, smatra se da je jedna od važnih komponenti rezistencije na lijekove u terapiji raka upravo ta epigenetička promjena. (16) Metiliranje DNA je promjena koja suprimira gensku ekspresiju, a koja nije uzrokovana promjenom u slijedu DNA, a prenosi se i na stanice kćeri. Metiliranje se događa dodavanjem metilne skupine (CH₃) uglavnom ugljiku na položaju br. 5 dušične baze citozin (C) unutar CG dinukleotida u tzv. CpG otocima. Promijenjeno metiliranje ili hipermetiliranje u promotorskim regijama nekih tumor-supresorskih te drugih važnih gena dovodi do promjena u biološkim procesima poput proliferacije, apoptoze, stanične diferencijacije, adhezije te u regulaciji staničnog ciklusa. (17) Ovo se događa poglavito u stanicama karcinoma, u kojima je zabilježena sveukupna hipometiliranost genoma (slika 1), što dodatno izaziva genomsku nestabilnost i vodi do transformacije stanica. (18) Metiliranje DNA je reverzibilan proces, što otvara nove mogućnosti pri upotrebi epigenetičkih terapijskih tehnika (19) te razvoja epigenetičkih lijekova, od kojih su neki već odobreni od agencija za lijekove (EMEA, European Commission and Medicines Agency; FDA, Food and Drug Administration) (20). Kako su epigenetičke promjene dinamične i reverzibilne, jasno je i da epigenetički enzimi također mogu predstavljati prikladne mete za razvoj učinkovitijih terapijskih strategija u liječenju tumora orofarinksa. (21)

Figure 1 Schematic representation of DNA methylation status in healthy and ill condition. In healthy condition, methylation occurs often on the most of cellular gene promoters, resulting in the absence of gene expression. In cancer, inflammation and other conditions, some relevant genes become methylated and as such, suppressed in their function. Accordingly, aberrant DNA methylation profiles can point to the diseased tissue, providing important information prior to treatment. Epigenetic drugs, such as demethylating agents (DNA methyltransferase (DNMT) inhibitors), for example azacytidine (AZAC) and decitabine (DEC), may be used to induce expression of the certain genes. Hypermethylated genes are presented in black, and hypomethylated in grey colour.

Metilacijski biomarkeri

Osim u karcinomima, promjena metiliranja DNA događa se i u drugim patološkim i nepatološkim stanjima te predstavlja dobar biomarker za različita stanja kao što su i tumori glave i vrata. Do sada su proučavani različiti geni čije promijenjeno metiliranje može ukazivati na tumore glave i vrata, poglavito tumore orofarinksa. Različiti autori ističu različite gene promijenjenog metiliranja kao moguće biomarkere tumora glave i vrata. (17,22–27)

Među prvima proučavanim bili su promotori gena za regulaciju staničnog ciklusa, p16INK4A i p14ARF, čija bi metiliranost ukazivala na razvoj tumora orofarinksa. Pokazalo se da je p16INK4A obećavajući mogući biomarker za predviđanje kliničkog ishoda ovih tumora, posebno za preživljavanje bez recidiva. (28) Nešto kasnija studija pronašla je učestalo metiliranje gena OCLN, CDKN2A, MGMT, MLH1 i DAPK1 u oralnim i orofaringealnim tumorima, s tim da su samo DAPK1 i MGMT imali prediktivnu vrijednost za nodalne metastaze. (29)

Ranije studije su među više kandidata za biomarkere tumora orofarinksa istaknule hipermetiliranje gena CDKN2A i CDH1, s tim da je metiliranost CDKN2A bila u korelaciji s boljom prognozom. (30) Zanimljivo, u nedavno objavljenoj studiji DNA-metiloma tumora glave i vrata Milutina Gašperova i suradnika, metodom Infinium MethylationEPIC BeadChip, među raznim potencijalnim biomarkerima upravo je hipermetilirani gen CDH1, uključen u staničnu adheziju, istaknut kao dobar biljeg za razlikovanje karcinoma od oralnih lezija te od zdrave oralne sluznice. (31)

Nadalje, Bai, et al. prepoznaju pet gena kao prognostičke biomarkere tumora glave i vrata, a ujedno i orofarinksa, značajno povezanih sa sveukupnim preživljavanjem, a to su PAX9, STK33, GPR150, INSM1 i EPHX3. (32) Guerrero-Preston, et al. također su našli značajno metiliranje promotora gena PAX, ali PAX1 i PAX5, u snažnoj korelaciji s inaktivacijom tumor-supresorskih gena p53 i NOTCH1, kao i metiliranje promotora dodatnih 10 tumor-supresorskih gena (GABRB3, HOXC12, PARP15, SLCO4C1, CDKN2A, PAX1, PIK3AP1, HOXC6, PLCB1, i ZIC4), inaktiviranih u tumorima metiliranjem promotora i/ili mutacijom. (33) Vezano uz preživljenje, Paluszczak, et al. pronalaze da je metiliranje gena WIF-1, negativnog regulatora Wnt-puta, u korelaciji s kraćim preživljenjem bolesnika s tumorima usne šupljine i orofarinksa te ga smatraju mogućim prognostičkim biomarkerom. (34)

Misawa, et al. su proučavali neinvazivne biomarkere poput cirkulirajuće tumorske DNA (ctDNA) te su zaključili da ona može biti značajna u ranoj dijagnozi te poboljšati ishode bolesnika s tumorima glave i vrata. (35) Testovima s ctDNA pokazano je da metiliranje triju gena, CALML5, DNAJC5G i LY6D, ima visoku prediktivnu sposobnost kao novi biomarker u razlikovanju plazme oboljelih od zdravih osoba. (36) Isti autori su proučavali odnos između statusa metilacije gena za neuropeptidne receptore, GHSR i NMUR1, i recidiva tumora glave i vrata, poglavito tumora orofarinksa, te ustanovili da značajno metiliranje promotora ovih gena korelira s lošijim preživljenjem u kirurški liječenih bolesnika. (37) Ista grupa autora je analizirajući gene GPCR (G protein-vezani receptori) otkrila da su značajno povezani recidivi i visoka metiliranost gena PTGDR1, PTGDR2 i PTGIR u uzorcima tumora orofarinksa povezanim s HPV-om. (35) Također, dokazano je da se HPV-infekcija u ovim tumorima mogla neovisno predvidjeti preko povećane metiliranosti gena iz superfamilije imunoglobulina, IGSF4. (9)

Nadalje, metiliranje regija mikroRNA (miR) također se proučavalo kao mogući biomarker raka. Tako su Minor, et al. pronašli da su metiliranost miR-9-1 i miR-9-3 osjetljivi i specifični biomarkeri za tumore usne šupljine i orofarinksa. (38)

Znanstvenici koji su istraživali korelaciju između hipermetiliranosti DNA i odgovora na zračenje našli su značajnu korelaciju između visokih razina metiliranja promotorske DNA i boljeg odgovora na liječenje, a koristeći 10 diferencijalno-metiliranih gena između onih koji su reagirali i onih koji nisu reagirali na zračenje. Dodatno su potvrdili 8 od 10 gena biomarkera: ROBO1, ULK4P3, MYOD1, LBX1, CACNA1A, IRX4, DPYSL3 i ELAVL2. (39)

Jedna od recentnijih studija Langdona, et al. proučavala je povezanost DNA metiliranja, prognostičkih čimbenika i preživljenja bolesnika s tumorima orofarinksa. Kod tih je bolesnika dokazana povećana metiliranost CpG mjesta unutar gena vezanih uz pušenje (SPEG, GFI1, i PPT2) i konzumaciju alkohola (KHDC3L); povezanost pušenja sa smanjenim preživljenjem dokazana je samo u slučaju gena SPEG. (40)

Svakako, količina studija te podataka o promijenjenom metiliranju gena u tumorima glave i vrata jest velika, a ovdje su navedeni samo najvažniji i najočitiji primjeri promijenjenih metilacijskih profila u tumorima orofarinksa. Uzimajući u obzir različitu metodologiju i opsege studija od najranijih pa do danas, čini se da se u najviše njih pojavljuje gen CDH1 (kadherin 1), odnosno njegovo promijenjeno metiliranje u uzorcima tumora naspram uzoraka normala. Naime, gubitak ekspresije ovoga gena pridonosi napredovanju raka povećavajući proliferaciju, invaziju i/ili metastaziranje.

Metilacijski lijekovi

Kako je hipermetiliranje DNA reverzibilna promjena, micanje metilnih skupina, odnosno naknadno hipometiliranje vodi prema reaktivaciji genske transkripcije, odnosno očitovanju gena (Figure 1). Stoga su takve epigenetičke promjene potencijalni mehanizam regulacije genske ekspresije na koji se može utjecati, a samim time i na bolest. Na tržištu već postoje demetilirajući lijekovi, analozi citozina, od kojih su trenutno u terapiji epigeničkog karcinoma najnapredniji 5-azacitozin (azacitidine, AZAC, 5-aza) i 2’-deoksi-5-azacitidin (decitabine, DEC). Ti spojevi djeluju kao inhibitori DNA metiltransferaza, a pokazali su se vrlo učinkovitim u reaktivaciji epigenetički utišanih gena te u suzbijanju tumora in vitro. (41) Konkretno, demetiliranje ovim lijekovima koristilo se u terapiji raka debelog crijeva, demetilirajući promotor gena za popravak DNA, hMLH1, što je rezultiralo vraćanjem funkcije ovoga gena te senzibiliziranjem tumorskih stanica na druge lijekove, kao što su cisplatina, karboplatina ili 5-fluorouracil. (16) Nadalje, 5-aza je u studiji Brieger, et al. doveo do ponovnog uspostavljanja ekspresije gena HIC1, koji djeluje kao regulator rasta i represije tumora, što je dovelo do smanjene agresivnosti stanica tumora glave i vrata. (42)

Nedavne studije su pokazale da su HPV-pozitivni tumori glave i vrata, odnosno orofarinksa, posebno osjetljivi na 5-aza, djelomično zbog smanjenja ekspresije gena HPV-a, a djelomično zbog obnavljanja tumor-supresora p53 i pRB. Pokazano je da 5-aza djeluje na HPV-pozitivne tumore glave i vrata tako da inducira replikaciju i dvostruke lomove DNA vezane uz transkripciju, što se događa prvenstveno kod demetilirane DNA. (43) Također, pokazano je da terapija ovih tumora s 5-aza može biti učinkovita kao alternativna ili kao nadopuna standardnih citotoksičnih terapija. (44) Međutim, u slučajevima HPV-pozitivnih tumora potreban je dodatan oprez kod upotrebe demetilirajućih lijekova, budući da može doći do aktivacije virusa micanjem metilnih skupina s određenih mjesta u inaktiviranom virusnom genomu. (45)

Nekodirajuća mikroRNA

Od njihova otkrića ranih 90-ih godina prošlog stoljeća, (46) molekule mikroRNA (miRNA) bile su perspektivni kandidati za biljege različitih tumora, pa tako i za tumore glave i vrata. (47,48) Molekule miRNA su male nekodirajuće molekule RNA, svega 18–24 nukleotida duljine, koje se vežu na ciljne mRNA molekule i utječu na njihovu stabilnost te posljedično ekspresiju ciljnih gena. (49) Trenutno je u najvećoj bazi molekula miRNA (miRBase v22) opisano više od 38.589 različitih molekula miRNA iz 271 organizma, dok ih je za čovjeka opisano 2.654. (50) Poznato je kako su miRNA molekule uključene u brojne fiziološke procese, uključujući proliferaciju, rast i razvoj organizama, metabolizam, apoptozu te su promijenjene u brojnim bolestima i promjenama. (51) Nažalost, dugogodišnji optimizam i potraga za idealnim miRNA-biljezima još uvijek nije urodila čvrstim rezultatima (52,53) niti u jednom od proučavanih tipova tumora glave i vrata. Mogući čimbenici koji su utjecali na slabu podudarnost dosadašnjih rezultata sigurno su bile razlike u metodama izolacije i detekcije molekula miRNA, prisustvo izomiR-a (subvarijante iste molekule miRNA), (54) te u konačnici velika heterogenost tumora glave i vrata koji imaju svoje specifične profile. (55) Osim toga, heterogenosti doprinose i različiti tipovi analiziranih materijala (svježe tkivo, parafinski preparati [engl. FFPE, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded], serum, slina). Budući da su molekule miRNA male, moguće ih je retrospektivno evaluirati i u parafinskim rezovima, što svakako olakšava pristup uzorcima. No, neki rezultati upućuju na to da, iako je tehnički izvedivo, postoji razmjerno malo slaganje u rezultatima dobivenim na različitom tipu tkiva te se tako samo 30–40% diferencijalno izraženih miRNA preklapa između svježih i parafinskih uzoraka istih pacijenata. (56)

Velika većina studija miRNA bila je fokusirana ili općenito na tumore glave i vrata u cjelini ili samo na pojedine subtipove, pa je relativno teško pronaći literaturu specifičnu za tumore orofarinksa, (57) iako je dosta pažnje posvećeno HPV-pozitivnim tumorima. (58) Primjer podzastupljenosti područja orofarinksa svakako je nedavno objavljena sveobuhvatna metaanaliza prognostičkog značaja miRNA u tumorima glave i vrata koja je identificirala 116 radova, od kojih se 62 pretežno odnosilo na tumore usne šupljine, 19 na grkljan (larinks), 19 na nazofarinks, 2 na hipofarinks te 14 radova na miješanim lokacijama uključujući i orofarinks. (59)

UTable 2 sažeti su trenutno dostupni rezultati s fokusom na područje orofarinksa. Pronađeno je trideset studija u kojima je bio barem dio uzoraka iz područja orofarinksa, dok je svega šest od njih bilo fokusirano isključivo na područje orofarinksa. Kako bi se smanjila kompleksnost, prikazane su samo miRNA koje su pronađene u barem dvjema od pronađenih studija, a u obzir su uzete samo studije s barem pet tumora orofarinksa. Kako je i prethodno spomenuto, uočeno je relativno slabo slaganje i preklapanje molekula miRNA impliciranih u razvoju tumora orofarinksa. Tako između 23 studije njih većina (12 studija) ukazuje na povišenje razine miR-21, dok su sljedeće najčešće implicirane bile miR-142 i miR-205 (u 5 studija). No, treba naglasiti da niti jedna od tih najčešćih miRNA nema u potpunosti konzistentne rezultate u pogledu smjera deregulacije u tumorima, osim miR-21.

Ekspresija miRNA 21 je učestalo poremećena u tumorima glave i vrata, ali i u drugim tipovima tumora. Uloga miR-21 nedavno je sažeta u preglednom radu Feng i Tsao. (82) Ukratko, ciljni geni miR-21 uključeni su u procese proliferacije i apoptoze, a bitna je i za regulaciju T-stanične imunosti. Povišena razina miR-21 značajka je razvoja mnogih solidnih tumora, kao što su gliom, rak dojke, rak debelog crijeva, rak nemalih stanica pluća te hematološki tumori. Posebno je zanimljiv prognostički značaj ove miRNA u tumorima općenito, ali i posebno u tumorima glave i vrata, što je dodatno potvrđeno nedavnom metaanalizom. (83)

MikroRNA 142 također je uključena u brojne važne procese poput staničnog rasta, diferencijacije, apoptoze, pa sve do embrionalnog razvoja i imunološkog odgovora. (84) Povezana je s raznim tumorima uključujući rak pluća, dojke, debelog crijeva, prostate, jajnika i vrata maternice, no, ovisno o kontekstu tumora, ili je utišana ili prekomjerno izražena. (85) Kao i za miR-21, postoje podatci o prediktivnoj vrijednosti ove miRNA u nekim tumorima. Za tumore glave i vrata ne postoje dokazi na razini metaanalize, no, postoje pojedinačne studije za neke subtipove tumora glave i vrata, gdje se ova miRNA pokazala kao potencijalni biljeg ishoda bolesti. (86,87)

Srednje učestale miRNA (miR-9, miR-106b, miR-145, miR-146a, miR-150, miR-155, miR-205;Table 2) zastupljene u manjem broju studija također su dovoljno učestalo proučavane da svaka ima barem jedan zaseban pregledni rad posvećen toj miRNA u kontekstu raka. (88–94) Redovito, svaka od navedenih može djelovati ili kao onkogen ili kao tumor-supresor, ovisno o kontekstu pojedinih tumora. Stoga nije neobično što i radovi u kontekstu tumora orofarinksa ponekad pokazuju povećanje, a ponekad smanjenje ovih molekula miRNA. S druge strane, miR-9 i miR-106b pokazale su veliku konzistentnost rezultata iako u samo po četiri od 23 studije svaka. Zanimljivo je i podsjetiti kako je metiliranje genomskih regija miR-9 gore već bilo opisano kao relevantno za nastanak tumora orofarinksa. (38)

Unatoč velikoj heterogenosti materijala i metoda te analiziranim tipovima tumora glave i vrata, moguće je pronaći određeno preklapanje u rezultatima analiza molekula miRNA. Redovito su učestalo opažene miRNA bile interesantni biljezi i u drugim tipovima tumora, a za gotovo sve molekule miRNA moguće je pronaći i radove koji evaluiraju prognostički učinak. Ipak, u toj količini podataka, pa čak i ukoliko se analiza ograniči samo na tumore orofarinksa, teško je odrediti najbitnije miRNA molekule s uvjerljivo konzistentnim rezultatima. Najbliže tomu je svakako miRNA-21.

Zaključak

Tumori glave i vrata su sami po sebi vrlo kompleksna i heterogena skupina, a kada se uvede analiza genetičke i/ili epigenetičke komponente u nastanku ovih tumora, još se dodatno produbi problematika. Analiza epigenetičke komponente, najčešće metiliranja DNA i regulacije pomoću miRNA, zapravo je analiza fine regulacije ekspresije gena. Kako je i prikazano, ovo je područje u posljednje vrijeme veliko polje interesa znanstvenika, a rezultati istraživanja su vrlo različiti i sveobuhvatni. Budući da je to ujedno i polje identifikacije novih, potencijalnih biomarkera ovih bolesti te njihovih predstadija, potrebno je vrlo detaljno i sustavno pristupiti ovom problemu te iz velikog skupa podataka odabrati najbolje potencijalne epigenetičke biljege, genske biomarkere s promijenjenim metiliranjem i/ili najvažnije miRNA, koje značajno mijenjaju ekspresiju gena u bolesnom stanju. U ovom radu nastojali smo istaknuti najvažnije epigenetičke biljege u tumorima glave i vrata povezanim s HPV-om, poglavito tumorima orofarinksa.