Izvorni znanstveni članak
Optimalni uvjeti za proizvodnju biomase i rekombinantne glicerol kinaze s pomoću kvasca Pichia pastoris
Raquel Aizemberg
; School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University – UNESP, Rodovia Araraquara-Jaú, Km 1, 14801-902 Araraquara-SP, Brazil
Werner D. M. Terrazas
; School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University – UNESP, Rodovia Araraquara-Jaú, Km 1, 14801-902 Araraquara-SP, Brazil
Suzana Ferreira-Dias
; Institute of Agronomy, CEER Biosystems Engineering, Technical University of Lisbon, Tapada da Ajuda, 1349-017 Lisbon, Portugal
Sandro R. Valentini
; School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University – UNESP, Rodovia Araraquara-Jaú, Km 1, 14801-902 Araraquara-SP, Brazil
Edwil A. L. Gattás
; School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University – UNESP, Rodovia Araraquara-Jaú, Km 1, 14801-902 Araraquara-SP, Brazil
Sažetak
Gen za ekstracelularnu glicerol kinazu iz Saccharomyces cerevisiae (GUT1) kloniran je u ekspresijski vektor pPICZα A i integriran u genom metilotrofnog kvasca Pichia pastoris X-33. Prisutnost GUT1 potvrđena je PCR analizom. Izdvojena su četiri klona, u kojima je ispitana funkcionalnost rekombinantnog enzima. Jedan je od ispitanih klonova imao aktivnost glicerol kinaze od 0,32 U/mL i specifičnu aktivnost proteina od 0,0025 U/mg. Podloga za maksimalnu proizvodnju biomase na tresilici s pomoću rekombinantnog kvasca Pichia pastoris optimirana je uporabom glicerola, volumnog udjela od 2,31 %, kao izvora ugljika. Za optimiranje je upotrijebljena metoda odzivnih površina. U preliminarnim su ispitivanjima, primjenom Plackett-Burmanovog dizajna, određeni najvažniji čimbenici što utječu na proizvodnju biomase, a to su: volumni udio glicerola (φ(Gly)) i vrijeme uzgoja (t). Daljnji su eksperimenti provedeni radi optimiranja proizvodnje biomase, a pratili su centralno složeni dizajn kao funkciju volumnog udjela glicerola i vremena. Volumni je udio glicerola imao pozitivni linearni utjecaj na proizvodnju biomase. Vrijeme uzgoja je također bitno utjecalo (na razini linearno pozitivnih i kvadratnih zavisnosti) na proizvodnju biomase. Eksperimentalni su se podaci dobro uklapali u konveksnu funkciju koja opisuje polinom drugoga reda, u kojem je biomasa funkcija obaju faktora (R²=0,946). Prinos i specifična aktivnost glicerol kinaze ponajprije su ovisili o dodatku glicerola i metanola podlozi. Sastav optimirane podloge za proizvodnju enzima bio je: 1 % kvaščeva ekstrakta, 1 % peptona, 100 mM fosfatnog pufera (pH=6,0), 1,34 % podloge s kvascem i dušikom, 4·10^-5 % biotina, 1 % metanola i 1 % glicerola, pomoću kojih je dobivena aktivnost glicerol kinaze od 0,89 U/mL i koncentracija ukupnih proteina od 14,55 g/L u podlozi nakon 48 sati uzgoja.
Ključne riječi
Pichia pastoris; rekombinantna glicerol kinaza; izvor ugljika; biomasa; metoda odzivnih površina
Hrčak ID:
71060
URI
Datum izdavanja:
10.8.2011.
Posjeta: 2.436 *